Overview
Это видео описывает мягкий агар колонии формирования анализа для проверки воздействия ингибитора фермента PADI и BB-Cl-амидин на рак молочной железы опухоли in vitro. Этот анализ также позволяет количественно оценить потенциал трансформации клеток в контексте генетических возмущений.
Protocol
1. Подготовка 3% 2-Гидроксиэтил Агароз
- В чистую, сухую стеклянную бутылку по 100 мл добавьте 0,9 г 2-гидроксиэтил агарозы (Агароз VII), а затем 30 мл дистиллированной воды.
- Микроволновая печь смесь в течение 15 сек и осторожно вихрем. Повторите этот шаг по крайней мере еще три раза, пока порошок агарозы полностью не растворится.
- Автоклав, содержащий раствор бутылки в течение 15 мин.
- Разрешить агарозный раствор остыть до RT перед дальнейшим использованием. Храните решение на RT.
2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозный гель
- Предварительно разогреть несколько 5 мл и 10 мл пипеток в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить затвердевение агарозы в пипетки при обработке.
- Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печи предварительно сделанные 3% 2-гидроксиэтил агарозный раствор в течение 15 сек. Затем осторожно закружить раствор и микроволновой печи еще 15 сек.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при закручении агарозного раствора, потому что раствор поднимается при воздействии воздуха и может перекинуться. - Если в бутылке есть остаточный твердый гель, микроволновая печь еще несколько секунд.
- Храните бутылку, содержащую раствор агарозы, в водяной бане с 45 градусами Цельсия во время следующих шагов, чтобы предотвратить преждевременное затвердевение раствора агарозы.
- Теплый MCF10DCIS средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
ПРИМЕЧАНИЕ: СРЕДСТВА MCF10DCIS состоят из DMEM/F12, 5% конской сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина. - Перенесите 3 мл 3% раствора агарозы с помощью предварительно разогретых пипеток в стерильную 50 мл конической трубки.
- Немедленно добавьте 12 мл теплого СРЕДСТВА MCF10DCIS и аккуратно инвертировать коническую трубку, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Старайтесь не образовывать пузырьки, так как это помешает колонии считать позже.
- Аккуратно добавьте 2 мл этой смеси в каждый колодец 6-хорошо культуры пластины без формирования каких-либо пузырьков воздуха.
- Инкубировать 6-хорошо культуры пластины горизонтально на плоской поверхности при 4 градусов по Цельсию в течение 1 часа, чтобы смесь затвердеть.
- После того, как смесь затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Нижний слой готов к использованию.
3. Подготовка клеточно-содержащего слоя: 0,3% агарозный гель
- Трипсинизировать клетки MCF10DCIS и разбавить их до концентрации клеток 4 х 104 /мл.
- Возьмите 2 мл 3% агарозы с помощью предварительно разогретых пипеток и перенесите в стерильную 50 мл конической трубки.
- Немедленно добавьте 8 мл средств MCF10DCIS в коническую трубку и аккуратно инвертировать, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Избегайте формирования каких-либо пузырьков.
- Возьмите 2 мл клеток MCF10DCIS (4 x 104 /мл) и обработать с помощью BB-CLA (0 МКМ (DMSO) или 1 МКМ).
- В разбавлении 1:1 смешайте клетки с 0,6% агарозой.
- Возьмите 1 мл клеточной агарозной смеси и аккуратно добавьте на нижний слой пластины культуры 6-колодец (2 x 104 клетки/мл).
- Поместите 6-хорошо культурную пластину горизонтально на плоскую поверхность при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 минут, чтобы верхний слой затвердеть.
- После того, как смесь затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение недели, прежде чем добавить слой кормления.
4. Подготовка кормового слоя: 0,3% Агароза Гель
- Микроволновая печь предварительно сделанные 3% 2-Гидроксиэтил агарозный раствор в течение 15 сек. осторожно закружить раствор и микроволновой печи еще 15 сек.
- Equilibrate бутылку раствора агарозы в водяной бане 45 градусов по Цельсию.
- Разогреть средства MCF10DCIS в водяной бане с 37 градусами Цельсия.
- Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплого СРЕДСТВА MCF10DCIS в 50 мл конической трубки и аккуратно инвертировать, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Избегайте формирования пузырьков воздуха.
- Лечить смесь с BB-CLA (0 ЗМ (DMSO) или 1 МКМ).
- Аккуратно добавьте 1 мл этой смеси (без формирования пузырьков) в каждый колодец из 6-колодец культуры пластины, содержащей нижние и мягкие слои.
- Поместите 6-хорошо культурную пластину горизонтально на плоскую поверхность при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 минут, чтобы позволить смеси затвердеть.
- После того, как слой фидер затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию.
- Повторяйте эту процедуру кормления еженедельно, накладав 1 мл 0,3% агарозы/среднего/лечения раствора на существующий слой подачи для пополнения клеток новыми носителями до тех пор, пока не будет наблюдаться образование колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агар в мягких и кормушки слоев очень мягкий и, следовательно, добавленные питательные вещества из фидерного слоя будет легко диффузных в клеточно-содержащий слой для достижения клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |