直接相互作用を伴う3D共培養:単球とがん細胞を共培養し、相互作用を研究する

1.3D直接の相互作用を伴う共文化

1. 細胞培養前に異なる蛍光色素を有するBrC細胞および単球を標識し、mRNAおよびタンパク質発現の分析のために培養後の各細胞系統の独立した選別を可能にする。生細胞の細胞膜を自由に通過するクマリンおよびローダミンの市販の誘導体を使用する。ラベル付けの一般的なプロトコルは次のとおりです。
   1. 目的のBrC細胞の単層(2×106細胞を25cm2培養フラスコ)で調製し、蛍光色素の十分な事前温め作業溶液(1:2,000の蛍光色素を添加せずに標準ベース培地に1:2,000)で置き換えます。加湿した5%CO2環境で37°Cで30分間インキュベートします。色素溶液を吸引し、十分な1倍PBSでやさしくすすめます。PBSを吸引し、標準培地を追加します。
   2. 37°Cで0.05%トリプシンと0.48 mM EDTAの溶液の2 mLで細胞単層をトリプシン化します。 200 μL の FBS を追加してトリプシンを停止し、対応媒体をサプリメントなしで 7 mL 追加します。ピペット処理で細胞を再中断します。10 μLのアリコートを取り、ノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。セルカウント後に共培養プロトコルを続行します。
   3. 細胞を430xgで5分間RTで5分間ペレット(単球が懸濁液で増殖してからこれを最初に行う)。上清を捨て、蛍光染料の3mLのあらかじめ温められた働く溶液(サプリメントなしで標準的な塩基媒体で蛍光染料の1:2,000)で細胞を穏やかに再懸濁します。加湿した5%CO2環境で37°Cで30分間インキュベートします。
   4. 再度細胞をペレットにし、色素の働く溶液を捨て、5~7mLの1x PBSで緩やかに再懸濁した。ペレットをもう一度、PBSを廃棄し、標準培地の5〜7mLで細胞を再懸濁させた。10 μLの細胞懸濁液のアリコートを取り、ノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。セルカウント後に共培養プロトコルを続行します。
2. コカルチャーを次のように設定します:4ウェルチャンバースライドシステムの各ウェルに均一な層を形成するためにウェルの底部に十分なECMEを広げます。プレート20μLは、ウェルあたり5×105標識BrC細胞を含む単一の細胞懸濁液である。
3. 37°Cで15〜20分のインキュベーションを行った後、80 μLアッセイ培地(60%ECMEを添加)に2.5 x 10⁵標識モノサイトの懸濁液を加えます。
4. ECMEを37°Cで15~20分間固める。
5. BrC細胞と単球培養培地の1:1ミックスを1 mL加えます。
6. 加湿した5%CO2環境で37°Cでの共培養を24時間、48時間、または5日間培養し、異なる時点での変化を追跡します。
7. ECMタンパク質を分解して培養物から細胞を回収する。吸引し、培地を廃棄し、0.1%トリプシンと0.25%EDTAで1x PBSの0.5mLを加え、37°Cで3時間インキュベートします。 インキュベーション後、10%FBSの1x PBSを0.5mL加えてトリプシンを中和し、精力的にピペット化して細胞を再懸濁し、単一細胞懸濁液を得た。
8. ペレット細胞はRTで5分間5分間、上清を捨て、10%FBSで5mLの1xPBSで細胞を再懸濁する。この手順を 1 回繰り返します。
9. 適切な器具を用いて蛍光活性化細胞選別(FACS)に細胞懸濁液を供する。最終的な母集団が少なくとも95%純粋であることを確認してください)。
10. 選別後、細胞を無菌1x PBS、ペレット(RTで5分間430xg)で洗浄し、滅菌1x PBSで再懸濁します。細胞は、RNAの単離またはタンパク質分析のための特定のプロトコルに従って処理することができる。
11. 各細胞系統の3D培養をコントロールとして含め、各アッセイを3回繰り返します。