Co-coltura 3D con interazione diretta: co-coltivare cellule tumorali con monociti per studiarne l'interazione

1.3D co-culture con interazione diretta

1. Etichettare le cellule BrC e i monociti con diversi coloranti fluorescenti prima della coltura cellulare per consentire lo smistamento indipendente di ogni lignaggio cellulare dopo la coltura per l'analisi dell'mRNA e dell'espressione proteica. Utilizzare derivati commercialmente disponibili di cumarina e rodamina che passano liberamente attraverso la membrana cellulare delle cellule viventi. Un protocollo generale per l'etichettatura è il seguente:
   1. Preparare un monostrato di cellule BrC di interesse (2 × 10^{6 celle} in un pallone da^{coltura da 25 cm 2)} e sostituire il mezzo standard con una soluzione di lavoro pre-riscaldata sufficiente del colorante fluorescente (1:2.000 del colorante fluorescente nel mezzo di base standard senza alcun supplemento). Incubare 30 min a 37 °C in un ambiente umidificato del 5% di CO_2. Aspirare la soluzione colorante e risciacquare delicatamente con sufficiente 1x PBS. Aspirare il PBS e aggiungere il supporto standard.
   2. Tripinare il monostrato cellulare con 2 mL di una soluzione di 0,05% di tripina e 0,48 mM EDTA per 5-10 min a 37 °C. Aggiungere 200 μL di FBS per interrompere la tripinazione e 7 mL del mezzo corrispondente senza integratori. Riutilizzare le celle mediante pipettazione. Prendere un'aliquota di 10 μL per contare le cellule in una camera Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle celle.
   3. Pellettizzare le cellule a 430 x g per 5 minuti a RT (eseguire questa prima da quando i monociti crescono in sospensione). Scartare le cellule supernatanti e delicatamente rimescolate con 3 mL di una soluzione di lavoro pre-riscaldata del colorante fluorescente (1:2.000 del colorante fluorescente in un mezzo di base standard senza integratori). Incubare per 30 min a 37 °C in un ambiente umidificato del 5% di CO_2.
   4. Pellettare nuovamente le cellule, scartare la soluzione di lavorazione del colorante e rimorsi delicatamente con 5-7 mL di 1x PBS. Pellet ancora una volta, scartare il PBS e rimosogliere le cellule in 5-7 mL di mezzo standard. Prendere un'aliquota di 10 μL di sospensione cellulare per contare le cellule in una camera Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle celle.
2. Impostare la co-coltura come segue: stendere abbastanza ECME nella parte inferiore del pozzo per formare uno strato uniforme in ogni pozzo di un sistema di scorrimento a camera a 4 pozzi. Piastra 20 μL di una singola sospensione cellulare contenente 5 × 10⁵ cellule BrC etichettate per pozzo.
3. Dopo 15-20 minuti di incubazione a 37 °C, aggiungere una sospensione di 2,5 x 10⁵ monociti etichettati in mezzo di dosaggio da 80 μL (integrato con il 60% di ECME).
4. Lasciare solidificare l'ECME per 15-20 min a 37 °C.
5. Aggiungere 1 mL di un mix 1:1 delle cellule BrC e dei mezzi di coltura dei monociti.
6. Incubare le co-colture a 37 °C in un ambiente umidificato del 5% di CO₂ per 24 ore, 48 ore o 5 giorni per tenere traccia dei cambiamenti in diversi punti di tempo.
7. Degradare le proteine ECM per recuperare le cellule dalle colture. Aspirare e scartare il mezzo, aggiungere 0,5 mL di 1x PBS con 0,1% di tripside e 0,25% EDTA e incubare per 3 h a 37 °C. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 mL di 1x PBS con FBS al 10% per neutralizzare la tripina e rimescolare le cellule tubazione vigorosamente per ottenere una sospensione a una cella.
8. Le celle a pellet a 765 x g per 5 minuti a RT, scartano il supernatante e rimescolano le cellule in 5 mL di 1x PBS con FBS al 10%. Ripetere questo passaggio una volta.
9. Sottoscrivi la sospensione cellulare allo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) con lo strumento appropriato. Assicurarsi che le popolazioni finali siano pure almeno al 95%).
10. Dopo lo smistamento, lavare le cellule con 1x PBS sterile, pellet (430 x g per 5 minuti a RT) e risospendare in 1x PBS sterile. Le cellule possono essere elaborate secondo protocolli specifici per l'isolamento dell'RNA o l'analisi proteica.
11. Ripeti ogni saggio tre volte, incluse le impostazioni cultura 3D di ogni singolo lignaggio cellulare come controlli.