Трансдукция на этикетку PDX Опухолевые клетки: Введение лентивируса Экспрессия флуоресцентного маркера в опухолевых клеток в пробирке

1. Трансдукция опухолевых клеток, полученных из PDX

1. Центрифуга размежевыв опухолевые клетки при 300 г х 5 мин и ресуспен в 2 мл маммосферных средств массовой информации. Подсчитайте жизнеспособные клетки, используя trypan голубое исключение (Resuspend переваренные клетки в буфере мытья 5 мл и подсчитайте как жизнеспособные, так и не жизнеспособные клетки, используя trypan голубое исключение. Короче говоря, смешать 50 мкл клеток и 50 мкл трипан синий и рассчитывать трипан-голубой исключая клетки с помощью гемоцитометра).
2. Приготовьте 10 мл маммосферных средств массовой информации, содержащих 8 мкг/мл полибрена (2 мл полибрена на мл мультимедиа).
3. Определите объем, необходимый для 2 х 10^{5 жизнеспособных} опухолевых клеток. Клетки центрифуги по 300 х г в течение 5 мин, и повторно гранулы в 2 мл полибрена, содержащего средства массовой информации. Плита 2 х 10^{5 жизнеспособных} опухолевых клеток на колодец в 6-ну ультра-низкой приверженности ткани культуры пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптимальное количество клеток, необходимых для трансдукции с одним лентивирусный вектор.
   ОСТОРОЖНО! Лентивирусные частицы и все расходные материалов, используемые с лентивирусными частицами, должны обрабатываться в соответствии с институциональными процедурами рекомбинантных биоопасных ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирусная трансдукция первичных клеток молочной железы сильно благоприятствует миоэпителиальным клеткам, что может привести к плохой маркировке светящихся клеток и отбору субпопуляций опухолевых клеток во время маркировки.
4. Инкубировать вирус с 200 мЕ/мл нейраминидазы при 37 градусов по Цельсию в течение 1 часа до трансдукции, чтобы увеличить привязку вирусных частиц к различным первичным подпопуляциям клеток и исправить для этого потенциального смещения.
5. Добавьте лентивирусные частицы при 10 MOI (2 x 10⁶ TU для 2 x 10^{5 жизнеспособных} клеток), если диссоциированные PDX клетки истощаются из клеток мыши Лине или обогащаются в клетках EpCam. Добавить лентивирусные частицы при 30 МВД (6 х 10⁶ TU для 2 х 10^{5 жизнеспособных} клеток) при использовании необогащенных PDX-диссоциированных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличенное МВД обеспечивает эффективную трансдукцию даже при наличии большого количества мусора и мертвых клеток в сырых экстрактах. Держите один хорошо с неоцеливой клетки, чтобы служить в качестве контроля за жизнеспособностью и эффективностью трансдукции.
6. Вихрь для смешивания вируса с клетками. Инкубационный при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ на срок до 96 часов. Добавьте 500 мкл свежих средств массовой информации маммосферы через 24 часа после трансфекции. Клетки не прикрепляются к пластинам, не аспирируют мультимедиа.

2. Оценка эффективности трансдукции и повторной имплантации помеченных клеток у мышей с ослабленным иммунитетом

1. Мониторинг экспрессии прослеживаемого маркера (GFP) каждые 24 часа с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении 10X.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение GFP можно наблюдать уже через 24 часа после заражения, но в большинстве PDXS выражение GFP хорошо видно после 72 часов(рисунок 1).
2. Оцените эффективность трансдукции, оценив процент клеток GFP в общей нуме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку культуры содержат опухолевые клетки, остаточные стромальные клетки и мертвые клетки в различной степени, скважины с 10% клеток GFP могут быть имплантированы в мышь-хозяина.
3. Передача трансфуцированных клеток из 6-хорошо пластин в 15 мл конической трубки. Добавьте 1 мл маммосферных средств массовой информации в колодец, чтобы собрать все клетки, оставшиеся позади. Место на льду.
4. Добавьте 10 мл HBSS/hepes в трансдуцированные клетки и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин, 4 градусов по Цельсию. Тщательно аспирировать супернатант и повторно в 50 мкл экстракт матрицы подвала (BME) на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BME aliquots должны быть разморожены на льду, 1 - 2 часа до использования. BME затвердеет при комнатной температуре; держать на льду во все времена.
5. Загрузите BME-встроенные клетки в 0,5 мл инсулинового шприца, держите на льду и поднесите в животное учреждение для реимплантации мышей NSG.

Рисунок 1: Отслеживание эффективности трансдукции в диссоциированных клетках PDX. A) PDX-диссоциированные клетки, обогащенные для эпителиальных клеток человека (истощение Лине) через 24 часа после трансдукции с pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentiviral частицами. B) PDX-диссоциированные клетки от отдельного эксперимента, без обогащения эпителиальных клеток, 72 часа после трансдукции с pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Обе панели показывают живые клетки. BF: Яркие полевые изображения, бар представляет 50 мкм