Transdução para Rotular células tumorais PDX: Introduzindo lentivírus expressando marcador fluorescente na célula tumoral in vitro

1. Transdução de células tumorais derivadas do PDX

1. Centrífuga dissociada células tumorais a 300 g x 5 min e resuspend em mídia mammosfera de 2 ml. Conte células viáveis usando exclusão azul trypan (Resuspend células digeridas em tampão de lavagem de 5 ml e conte células viáveis e não viáveis usando exclusão azul trypan. Resumidamente, misture 50 μl de células e 50 μl de azul trypan e conte células de exceção trypan-azul usando um hemótmetro).
2. Prepare 10 ml de mídia de mammosfera contendo 8 μg/ml de polibrene (2 μl de polibrene de estoque por ml de mídia).
3. Determine o volume necessário para 2 x 10⁵ células tumorais viáveis. Centrífugas a 300 x g por 5 min, e pelotas resuspend em 2 ml de polibrene contendo mídia. Placa 2 x 10⁵ células tumorais viáveis por poço em uma placa de cultura de tecido de adesão ultra-baixa de 6 poços.
   NOTA: Este é um número ideal de células necessárias para a transdução com um vetor lentiviral.
   ATENÇÃO! Partículas lentivirais e todos os consumíveis usados com partículas lentivirais devem ser manuseados seguindo procedimentos institucionais para riscos biológicos de DNA recombinante.
   NOTA: A transdução lentiviral das células mamárias primárias favorece fortemente as células mioepitheliais que podem resultar em má rotulagem de células luminais e seleção de subpopulações de células tumorais durante a rotulagem.
4. Incubar o vírus com 200 mU/ml neuraminidase a 37 °C por 1 hora antes da transdução para aumentar a ligação de partículas virais a diferentes subpopulações de células primárias e corrigir esse viés potencial.
5. Adicione partículas lentivirais a 10 MOI (2 x 10⁶ TU para 2 x 10⁵ células viáveis) se as células dissociadas do PDX forem esgotadas de células do rato Lin+ ou enriquecidas em células EpCam+. Adicione partículas lentivirais a 30 MOI (6 x 10⁶ TU para 2 x 10⁵ células viáveis) se usar células dissociadas PDX não enriquecidas.
   NOTA: O aumento do MOI permite uma transdução eficiente mesmo na presença de grandes quantidades de detritos e células mortas em extratos brutos. Mantenha um bem com células não rotuladas para servir como controle para a viabilidade e eficiência de transdução.
6. Redemoinho para misturar vírus com células. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por até 96 horas. Adicione 500 μl de mídia de mamografia fresca 24 horas após a transfecção. As células não se anexam às placas, não aspiram a mídia.

2. Avaliação da Eficiência transdução e re-implantação de células rotuladas em camundongos imunocomprometidos

1. Monitore a expressão do marcador rastreável (GFP) a cada 24 horas usando um microscópio fluorescente na ampliação de 10X.
   NOTA: A expressão GFP pode ser observada até 24 horas após a infecção, mas na maioria dos PDXs a expressão GFP é claramente visível após 72 horas(Figura 1).
2. Estime a eficiência da transdução avaliando o percentual de células GFP+ dentro do poço total.
   NOTA: Uma vez que as culturas contêm células tumorais, células estromicanas residuais e células mortas em vários graus, poços com até 10% de células GFP+ podem ser implantados em um camundongo hospedeiro.
3. Transfira células transduzidas de placas de 6 poços para um tubo cônico de 15 ml. Adicione 1 ml de mídia de mammosfera ao poço para coletar todas as células deixadas para trás. Coloque no gelo.
4. Adicione 10 ml de HBSS/hepes às células transduzidas e centrífuga a 300 x g por 5 min, 4 °C. Aspirar cuidadosamente supernasce e resuspend em extrato de matriz de porão de 50 μl (BME) no gelo.
   NOTA: As alíquotas BME devem ser descongeladas no gelo, 1 - 2 horas antes do uso. A BME se solidificará à temperatura ambiente; manter no gelo o tempo todo.
5. Carregue células incorporadas ao BME em uma seringa de insulina de 0,5 ml, mantenha no gelo e leve para a instalação animal para reimplantação em camundongos NSG.

Figura 1: Rastreamento da Eficiência de Transdução em Células PDX Dissociadas. A) Células dissociadas por PDX enriquecidas para células epiteliais humanas (esgotamento de Lin+) 24 horas após a transdução com partículas lentiviras pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) Células dissociadas pDX de um experimento separado, sem enriquecimento celular epitelial, 72 horas após a transdução com pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Ambos os painéis mostram células ao vivo. BF: Imagens de campo brilhante, barra representa 50 μm