PDX Tümör Hücrelerini Etiketlemeye Dönüştürme: Tümör Hücresi In Vitro'ya Floresan İşaretleyiciyi İfade Eden Lentivirüs'ün Tanıtılması

1. PDX türevi Tümör Hücrelerinin Transdüksiyon

1. Santrifüj 300 g x 5 dk'da tümör hücrelerini ayırır ve 2 ml mammosfer ortamlarında yeniden biriktirir. Trypan mavi dışlama kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın (Sindirilmiş hücreleri 5 ml yıkama tamponunda yeniden yaşayın ve trippan mavi dışlama kullanarak hem uygulanabilir hem de canlı olmayan hücreleri sayın. Kısaca, 50 μl hücre ve 50 μl trippan mavisi karıştırın ve bir hemositometre kullanarak trypan-blue hariç hücreleri sayın).
2. 8 μg/ml polibren (ml ortam başına 2 μl stok polibren) içeren 10 ml mammosfer ortamı hazırlayın.
3. 2 x 10⁵ uygun tümör hücresi için gereken hacmi belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ve ortam içeren 2 ml polibrende pelet resuspend. Plaka 2 x 10⁵ canlı tümör hücresi kuyu başına 6-kuyu ultra düşük yapışma doku kültürü plakasında.
   NOT: Bu, bir lentiviral vektör ile transdüksiyon için gereken en uygun hücre sayısıdır.
   DİkKAT! Lentiviral parçacıklar ve lentiviral parçacıklarla kullanılan tüm sarf malzemeleri, rekombinant DNA biyolojik tehlikeleri için kurumsal prosedürleri takiben ele alınmalıdır.
   NOT: Primer meme hücrelerinin lentiviral transdüksiyonu, luminal hücrelerin zayıf etiketlenmesine ve etiketleme sırasında tümör hücrelerinin subpopulasyonlarının seçilmesine neden olabilecek miyoepithelial hücreleri güçlü bir şekilde tercih eder.
4. Viral parçacıkların farklı birincil hücre alt nüfuslarına bağlanmasını artırmak ve bu potansiyel önyargıyı düzeltmek için transdüksiyondan önce 1 saat boyunca 37 °C'de 200 mU/ml neuraminidaz ile virüsü kuluçkaya yatırın.
5. PDX'ten ayrışmış hücreler Lin+ fare hücrelerinden tükenirse veya EpCam+ hücrelerinde zenginleştirilirse, 10 MOI'de⁽² x 10⁶ TU, 2 x 10 5 uygulanabilir hücre için) lentiviral parçacıklar ekleyin. Zenginleştirilmiş olmayan PDX ayrışmış hücreler kullanıyorsanız, 30 MOI'de (2 x 10 5 uygulanabilir hücre için⁶ x 10⁶ TU) lentiviral parçacıklar ekleyin.
   NOT: Artan MOI, ham özlerde büyük miktarda enkaz ve ölü hücrelerin varlığında bile verimli bir transdüksiyon sağlar. Canlılık ve transdüksiyon verimliliği için bir kontrol görevi görmek için etiketlenmemiş hücrelerle iyi tutun.
6. Virüsü hücrelerle karıştırmak için girdap. 37 °C'de kuluçkaya yatır, 96 saate kadar_{%5 CO 2.} Transfeksiyondan 24 saat sonra 500 μl taze mammosfer ortamı ekleyin. Hücreler plakalara bağlanmaz, ortam aspire etmez.

2. İmmün Sistemi Baskılanmış Farelerde Transdüksiyon Verimliliğinin Değerlendirilmesi ve Etiketli Hücrelerin Yeniden yerleştirilmesi

1. 10X büyütmede floresan mikroskop kullanarak her 24 saatte bir izlenebilir işaretleyicinin (GFP) ifadesini izleyin.
   NOT: GFP ekspresyonu enfeksiyondan 24 saat sonra görülebilir, ancak çoğu PDX'te GFP ifadesi 72 saat sonra açıkça görülebilir (Şekil 1).
2. Toplam kuyu içindeki GFP+ hücrelerinin yüzdesini değerlendirerek transdüksiyonun verimliliğini tahmin edin.
   NOT: Kültürler tümör hücreleri, kalıntı stromal hücreler ve çeşitli derecelerde ölü hücreler içerdiğinden, konak fareye% 10'a kadar düşük GFP+ hücrelerine sahip kuyular implante edilebilir.
3. Transdüklenmiş hücreleri 6 kuyulu plakalardan 15 ml konik bir tüpe aktarın. Geride kalan tüm hücreleri toplamak için kuyuya 1 ml mammosfer ortamı ekleyin. Buzun üzerine koy.
4. Transdüklenmiş hücrelere 10 ml HBSS / hepes ekleyin ve 5 dakika, 4 ° C için 300 x g'da santrifüj ekleyin. Buz üzerinde 50 μl bodrum matris özünde (BME) supernatant ve resuspend'i dikkatlice aspire edin.
   NOT: BME aliquots, kullanmadan önce 1 - 2 saat buz üzerinde çözülmelidir. BME oda sıcaklığında katılaşmayacaktır; her zaman buzda tutun.
5. BME gömülü hücreleri 0,5 ml'lik bir insülin şırıngına yükleyin, buzda tutun ve NSG farelerine yeniden dikim için hayvan tesisine getirin.

Şekil 1: Ayrışmış PDX Hücrelerinde Transdüksiyon Verimliliğini İzleme. A) PSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentiviral parçacıklarla transdüksiyondan 24 saat sonra insan epitel hücreleri (Lin+ tükenmesi) için zenginleştirilmiş PDX-dissositasyonlu hücreler. B) PDX-dissositlenmiş hücreler ayrı bir deneyden, epitel hücre zenginleştirmesi olmadan, pHAGE-EF1aL-luciferaz-UBC-GFP-W ile transdüksiyondan 72 saat sonra. Her iki panel de canlı hücreleri gösterir. BF: Parlak alan görüntüleri, çubuk 50 μm'yi temsil eder