고도 정화 구하기 Toxoplasma gondii Oocysts

<p class="jove_title"> 1. 작업 일반 안전주의 사항<em> T. gondii</em> oocysts</p><ol><li>이 작업을 할 때 모든 안전 조치를 수행하는 것이 중요합니다<em> T. gondii</em> oocysts. 대부분의 건강한 개인에서,<em> T. gondii</em> 감염이 쉽게 면역 시스템에 의해 제어되지만, 평생 감염 결과. Immunocompromised 개인 toxoplasmosis 특히 민감한 및 처리해서는 안<em> T. gondii</em> oocysts. 임산부도 처리하지 말아야<em> T. gondii</em> oocysts, 감염이 심각한 출생 결함을 일으킬 수 있기 때문에⁸.</li><li<em> T. gondii</em> oocysts은 지정된 장소에서 훈련받은 인력으로 취급해야합니다. 표시 간판<em> T. gondii</em> oocyst 작업이 진행이 지정된 영역을 입력 다른 사람을 경고에 ​​게시해야합니다.</li><li취급시>와 같은 실험 복을 적절한 개인 보호 장비 (PPE), 일회용 가운, 일회용 장갑, 적절한 눈 보호 또는 얼굴 방패를 착용<em> T. gondii</em> oocysts.</li><li> 자주 장갑 변경하는 것이 좋습니다. 있는 모든 실험실 장비를 취급하지 마십시오<em> T. gondii</em> oocyst 장갑을 오염.</li><li함께 작업할 때> 항상 일회용 흡수 라이너 줄지어 금속 autoclavable 트레이를 사용하여<em> T. gondii</em> oocysts. 사용되는 모든 랙, 튜브 등을 확인 일회성 또는 autoclavable 있습니다.</li><li> 전체<em> T. gondii</em> 폐기물은 적어도 한 시간 동안 두 번 autoclaved해야합니다.</li><li> 모든 비 일회용 장비는 (랙, 쟁반 등) 또한 적어도 하나의 시간 동안 두 번 autoclaved해야합니다.</li><li액체 대기음하는 데 사용> 진공 라인은 진공 펌프의 오염을 방지하기 위해 Vacushield ™ 필터에 연결되어 있어야합니다.</li><li> 모든 영향을 실험실 벤치 정상은 작업을 마친 후 소독해야합니다<em> T. gondii</em> oocysts. 갓 만들어진 10 %의 차아 염소 산염은 후한 작업 영역에 적용하고 건조 허용해야합니다. 지역은 다음 물로 잘 씻어서해야합니다.</li></ol><p class="jove_title"> 2. 버퍼 및 솔루션의 준비</p><ol><li> 600 ML ddH에서 자당의 752.66 g을 용해하여 자당의 1 패 2.2 M 용액을 준비₂ O. 휘저어과 자당을 해산하기 위해 가열 저어 접시를 사용하여 부드럽게 열. 일단 완전히 용해, ddH 1 L에 볼륨을 가지고₂ O. 이것은 최소한 20 분 동안 솔루션을 autoclaving하여 살균 뒤에해야합니다.</li><li> ddH 700 ML에 트리스 – HCL의 6.05 g 및 3.7 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하여 1L TE 버퍼 (50 MM 트리스 – HCL, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 산도 7.2 준비₂ O, 7.2 산도를 조정 다음 ddH 1 L에 볼륨을 가지고₂ O.</li><li> CsCl 그라데이션 들어, TE 버퍼의 103.25 ML과 CsCl의 21.75 g을 추가하여 1.15 (1.15 – CsCl)의 비중과 CsCl의 주식 솔루션을 준비합니다. 솔루션, 1.15 – CsCl 20 ML과 TE 30 ML을 섞는다. 솔루션 B의 경우, 1.15 – CsCl 30 ML 및 페놀 레드 솔루션의 12.5 μl와 TE 20 ML을 섞는다. 솔루션 C 들어, 1.15 – CsCl (표 1) 40 ML과 TE 10 ML을 섞는다.</li><li> ddH 800 ML에 NaOH의 40g를 용해하여 수산화 나트륨 (NaOH)의 1L 1 N 솔루션을 준비₂ O. 일단 해산, ddH 1 L에 볼륨을 가지고₂ O.</li><li> H의 1 패 2퍼센트 (부피로) 솔루션을 준비₂ SO<sub> 4</subH의> 혼합 20 ML₂ SO₄ ddH의 980 ML과₂ O.</li></ol><p class="jove_title"> 3. 자당 플로트</p><ol><li>의 배설물 정지 10 ML 추가<em> T. gondii</em> oocysts에 2% H₂ SO₄ 50 ML 원뿔 원심 튜브에. 그것은 배설물 서스펜션과 같이 이전에 설명한 자당의 부양 절차를 통해 미리 처리된 시료를 말합니다 있다고 지적해야합니다⁸. 배설물 샘플을 처음에 감염된 고양이를 수확하는 경우 그들은 같은 참조 8 설명된 자당 플로트를 통해 처리됩니다. 이 추가 자당 플로트 추가 CsCl 정제 과정 이월 지저분한 이물질을 최소화하고 순수한을 얻을 필요가 있습니다<em> T. gondii</em가능> oocysts.</li><li> 2 % H를 무력화₂ SO₄ 배설물로 정지 1 N NaOH 6 ML (3 / 5 볼륨)을 추가하여. vortexing하여 잘 섞는다.</li><li> 배설물로 정학 1.1 M의 최종 농도를 생성 2.2 M의 자당의 동일한 볼륨 (16 ML)를 추가하고 vortexing하여 잘 섞는다.</li><li> 조심스럽게 10 ML ddH와 함께 자당 / 배설물 서스펜션을 오버레이₂ O는 10 ML의 피펫을 사용합니다. 없이 브레이크와 함께 실온에서 20 분 1,200 XG에 현탁액을 원심 분리기.</li><li> 조심스럽게 상단 물과 계면 레이어를 수집하고 피펫을 소용돌이 치는 않고 공기 물 인터페이스에서 pipetting하여 새 50 ML 원뿔 원심 튜브로 전송할 수 있습니다. 계면 층을 수집하면서 자당의 carryover를 최소화하는 것이 중요합니다.</li><li> 튜브를 vortexing하여 나머지 자당 / 배설물 펠렛 솔루션을 섞습니다.</li><li> 반복 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다.</li><li> ddH과 함께 50 ML에 두 oocyst의 계면 솔루션의 볼륨을 가져와₂ O와 실온에서 10 분 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.</li><li> 함께 5 ML TE 버퍼와 풀 oocyst 중지와 각 튜브의 표면에 뜨는 및 resuspend 알약을 대기음. 총 풀링 볼륨은 10 ML해야합니다.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CsCl 기울기</p><ol><li> 신중 18 autoclavable, 무딘 엔드 게이지, 강철 바늘, 그리고 2 웨이 스톱 콕과 함께 50 ML의 주사기를 사용하여 각 레이어를 underlaying하여 50 ML 폴리 카보 네이트 오크 리지 관에서 불연속 CsCl 그라디언트를 준비합니다. 참고 : 페놀 레드가 쉽게 그라디언트 레이어 (표 1)를 구분하는 솔루션 B에 추가됩니다.</li><li> 천천히 아래 나열된 순서에 따라 튜브에 다음 솔루션을 추가합니다. 이것은 유량 이상 0.5 ML / 초를 초과하지 말아야 것을인지해야합니다.<ol><lite > 10 ML</li><li> 8 ML 솔루션</li><li> 8 ML 솔루션 B</li><li> 8 ML 솔루션 C</li></ol></li><li> 4 60 분 °없이 브레이크와 C에 대해 12000 XG에있는 오크 리지 튜브를 원심 분리기. 고정 각도 로터의 사용은 허용하지만, 측면이나 튜브를 따라 최소한의 지저분한 부스러기 얼룩과 정지 샘플에서 oocysts를 더 잘 분리 양동이 결과를 스윙 고속. 얼룩의 정도는 배설물로 정학의 구성에 따라 다릅니다 때문에 그것은 배설물로 정학 매우 더러운 경우이 CsCl 그라디언트을 수행하기 위해 필요할 수 있습니다.</li><li> 다음 원심 분리, 지저분한 이물질로 오염을 최소화하기 위해 솔루션 A와 B 사이의 흰색 / 불투명 oocyst 포함하는 밴드를 수집, 그라데이션을 방해하지 않고 oocyst 밴드에 직접 가서 10 ML의 피펫을 사용하여 oocyst의 계면를 수집합니다. 새로운 50 ML 원뿔 원심 튜브에 oocyst 계면을 전송합니다. 그것은 씻어 단계 동안 oocysts를 pelleting에 문제를 일으킬 수 있으므로 oocyst 계면를 수집하는 동안 aspirated CsCl 용액의 양을 최소화하기 위해보십시오.</li><li> ddH의 30-40 ML과 oocysts 와시₂ O. 브레이크없이 10 분 상온에서 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. oocyst 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 주의깊게 대기음. 세척 2 개의 번 반복합니다.</li><li> 최종 세척 끝에 신중하게 뜨는을 대기음 사용까지 4 10 ML 2 % 황산과 저장소에있는 펠렛 ° C를 resuspend. Oocysts 이제 더 이상 조작을위한 준비가되어 있습니다. Oocyst 순도는 샘플의 배설물 파편의 부재에 의해 미세하게 확인하실 수 있습니다.</li></ol>