取得高纯度弓形虫卵囊
Summary
这项研究描述了修改后的铯的方法，可以轻松地净化适用于分子生物学和组织培养操作感染的猫粪的弓形虫卵囊的发展
Abstract
弓形虫是专性细胞内原虫通常感染人类的病原体。这是一个很好的特点apicomplexan导致食物和水传播的疾病暴发。终宿主是猫科动物性复制，结果导致发生发展的高度传染性和环保耐的卵囊。通过组织囊肿的摄入受污染的肉类或从土壤或水中的卵囊感染发生。感染通常无症状的健康人，但在终身潜伏感染的结果，可以重新成为免疫功能低下引起弓形虫脑炎和死亡，如果个人。肉类污染， 以 T 弓形虫包囊已经在欧洲和美国感染的主要来源， 但 T的患病率显着降低动物管理和饲养方法的最新变化和提高粮食处理和加工程序2肉1， 弓形虫包囊。然而，在人类的血清阳性率仍然相对较高，表明从卵囊污染的土壤或水的接触是可能的。事实上，水性弓形虫病疫情报告，全球支持的理论接触的环境卵囊形成造成了巨大的健康风险3-5。迄今为止，了解T 的患病率的研究弓形虫卵囊在水和环境是有限的，由于缺乏工具来检测环境中的5，6卵囊。这主要是由于缺乏获得大量的高度纯化的T弓形虫卵囊感染的猫为研究目的的高效净化协议。这项研究描述了一个修改后的CSCL方法，轻松地净化T.的发展适用于分子生物学和组织培养操作 7感染的猫粪便中弓形虫卵囊。
Protocol
<p class="jove_title"> 1。一般工作时的安全防范措施<em> T。弓形虫</em>卵囊</p><ol><li>它工作时，重要的是要遵循所有的安全预防措施<em> T。弓形虫</em>卵囊。在大多数健康的人，<em> T。弓形虫</em>感染是容易控制的免疫系统;然而，终身感染的结果。免疫功能低下的人特别容易受到弓形体病，不应该处理<em> T。弓形虫</em>卵囊。孕妇应该也不会处理<em> T。弓形虫</em>卵囊，因为感染可引起严重的出生缺陷<sup> 8</sup>。</li><li<em> T。弓形虫</em>卵囊只应在指定的区域和训练有素的人员来处理。迹象表明<em> T。弓形虫</em>卵囊的工作过程中，必须张贴，以提醒其他人进入指定的区域。</li><li>处理时穿戴如白大褂适当的个人防护装备（PPE）的，一次性礼服，一次性手套，和适当的保护眼睛或面罩<em> T。弓形虫</em>卵囊。</li><li建议>的频繁手套变化。不要处理任何实验室设备<em> T。弓形虫</em>卵囊污染的手套。</li><li>始终使用高压灭菌的托盘金属内衬用一次性吸水衬垫，工作时<em> T。弓形虫</em>卵囊。确保所有机架，管等使用一次性或高压灭菌。</li><li><em> T。弓形虫</em>废物必须至少有一个小时的蒸压两次。</li><li>所有非一次性设备（货架，托盘等），还必须至少有一小时两次进行高压灭菌。</li><li用来吸液体的真空线应连接到一个Vacushield™过滤器，以防止污染真空泵。</li><li>所有受影响的实验台台面必须进行消毒处理后完成的工作与<em> T。弓形虫</em>卵囊。新鲜的10％的次氯酸钠，应从优应用到工作区，并允许干。然后必须用清水冲洗以及该地区。</li></ol><p class="jove_title"> 2。缓冲区和解决方案的制备</p><ol><li>准备752.66克蔗糖溶解在600毫升DDH的蔗糖1升2.2 M解决方案<sub> 2</sub> O。轻轻搅拌并加热，使用加热搅拌板，溶解的蔗糖。一旦完全溶解，带来体积1 L与DDH<sub> 2</sub> O。其次是消毒，这应该是通过高压灭菌至少20分钟的解决方案。</li><li>准备加入的DDH 700毫升6.05克和3.7克的EDTA的Tris – HCl一个1L TE缓冲液（50毫米的Tris – HCl，10 mM的EDTA），pH值7.2<sub> 2</sub> 0，调节pH值至7.2，然后把卷1 L与DDH<sub> 2</sub> O。</li><li> CsCl梯度，准备与比重的1.15（1.15 – CSCL）一个中海集运的股票解决方案，通过增加21.75与103.25毫升TE缓冲液中海集运克。解决一个，混合的TE 30毫升，20毫升1.15铯。对于解决方案B，混合30毫升1.15铯和12.5μL酚红溶液20毫升的TE。对于溶液C，1.15，中海集运（见表1）与40毫升混合10毫升的TE。</li><li>准备一个1L 1氢氧化钠（NaOH）ñ解决方案的NaOH溶解40克，在800毫升的DDH<sub> 2</sub> O。一旦溶解，体积1 L与DDH<sub> 2</sub> O。</li><li>准备1升2％（体积比）的H解决方案<sub> 2</sub><sub> 4</sub>混合20毫升的H<sub> 2</sub><sub> 4</sub>用980毫升的DDH<sub> 2</sub> O。</li></ol><p class="jove_title"> 3。蔗糖浮动</p><ol><li>添加10毫升的粪便暂停<em> T。弓形虫</em>卵囊，在2％的H<sub> 2</sub><sub> 4</sub，到50毫升锥形离心管。必须指出的是，粪便悬浮是指已通过蔗糖浮选如前面所述的程序预先处理的样品<sup> 8</sup>。当最初是从被感染的猫收获的粪便样品处理它们通过参考文献8蔗糖浮动。这额外的蔗糖浮动是必要的，以进一步减少粪便碎片结转到铯净化过程，并获得最纯净的<em> T。弓形虫</em>卵囊可能。</li><li>中2％的H<sub> 2</sub><sub> 4</sub加入6毫升（3><li>添加2.2创建一个终浓度为1.1米的粪便被停牌蔗糖等体积（16毫升），拌匀由涡旋。</li><li>小心覆盖10毫升DDH的蔗糖/粪便悬浮<sub> 2</sub> O使用10毫升吸管。离心机在1200 XG没有刹车的温度在室温20分钟的暂停。</li><li>小心收集顶水和相间层，没有纷飞的吸管移液从空气 – 水界面转移到一个新的50毫升锥形离心管。同时收集相间层，重要的是要尽量减少蔗糖结转。</li><li>混合余下的蔗糖，由涡旋管/粪便颗粒的解决方案。</li><li>重复步骤3.4和3.5。</li><li>带两个卵囊相间的解决方案与DDH容至50 ml<sub> 2</sub> O和离心管在室温下10分钟在2000 XG。</li><li>从每管5毫升TE缓冲液池的卵囊悬液上清，悬浮颗粒吸在一起。总汇集量应该是10毫升。</li></ol><p class="jove_title"> 4。 CsCl梯度</p><ol><li>仔细underlaying的每一层，使用18号钝端，高压灭菌，钢针，和2路停止公鸡50毫升的注射器，准备在50毫升的聚碳酸酯橡树岭管一个不连续的CsCl梯度。注：酚红被添加到解决方案B，以容易区分的梯度层（见表1）。</li><li>慢慢地在下面列出的顺序添加下面的解决方案，以管。应该指出，流速不应超过超过0.5毫升/秒。<ol><li> 10毫升TE /卵囊悬浮样品</li><li> 8毫升溶液A</li><li> 8毫升溶液B</li><li> 8毫升溶液C</li></ol></li><li在12000 XG离心60分钟，4 °与没有刹车的橡树岭管。使用一个固定的角度转子是可以接受的的，但高速摆动更好的卵囊的分离，从最小的粪便碎片涂片沿一侧或管悬挂样品桶结果。涂片的程度上取决于粪便悬浮液的组成，因此可能需要执行两个铯梯度，如果粪便悬浮非常脏。</li><li>离心后，收集的不透明/白色卵囊含带之间的解决方案A和B，为了尽量减少粪便碎片污染，直接进入到卵囊频段互不干扰梯度，并收集卵囊相间，使用10毫升吸管。卵囊相间转移到一个新的50毫升锥形离心管。尽量减少吸气的解决方案中海集运的数量，而收集的卵囊相间，因为它可能造成在制粒过程中的清洗步骤卵囊的问题。</li><li>洗净与30-40毫升的DDH卵囊<sub> 2</sub> O。在2000 XG在室温为10分钟，没有刹车，离心管。没有令人不安的卵囊颗粒，小心吸上清液。重复洗额外的2倍。</li><li在最后一次洗涤结束，小心吸出上清液，重悬，直到使用10毫升2％的硫酸和存储颗粒在4 ° C。卵囊现在准备进一步的处理。卵囊的纯度可通过显微镜检查粪便碎片样品的情况下。</li></ol>
Acknowledgements
我们想感谢的技术审查，技术和行政支持的手稿和阿布赛义德博士和琳达Ransick蔻布林克曼和迈克尔洁具。美国通过其部分资金和研究合作的研究和发展办公室的环境环保局这里描述根据合同编号EP – D – 06 – 096 Dynamac公司和一个机构间协议DW – 12 – 92289801 – 0美国农业部。它一直受到机构的审查和出版批准。提及的贸易名称或商业产品并不构成认可或推荐使用。 MJS当前地址：Dynamac，公司辛辛那提，俄亥俄州。
Referencias
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Citar este artículo
Staggs, S. E., See, M. J., Dubey, J. P., Villegas, E. N. Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient. J. Vis. Exp. (33), e1420, doi:10.3791/1420 (2009).