Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Todas as formas de vida requerem enzimas de processamento de ácido nucleico para realizar processos biológicos fundamentais, incluindo replicação, transcrição e reparo de DNA. As principais funcionalidades enzimáticas para essas vias são polimerases, que geram cópias de moléculas de RNA/DNA, ligases que unem substratos polinucleotídeos, nucleases que os degradam e helicases e topoisomerases, que fundem duplex de ácidos nucleicos ou alteram sua topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Além disso, muitas dessas enzimas fornecem ferramentas moleculares essenciais para aplicações como clonagem, diagnóstico e sequenciamento de alto rendimento 11,12,13,14,15.

As características funcionais, cinética e especificidades de substrato dessas enzimas podem ser determinadas usando substratos de DNA/RNA marcados produzidos por oligonucleotídeos de recozimento. O rastreamento de substratos e produtos tem sido tradicionalmente alcançado pela introdução de um marcador radioativo (³²P) na extremidade da fita 5 ‘, que pode então ser detectado por filme fotográfico ou com um sistema de imagem de fósforo^{16 , 17} . Embora os substratos radiomarcados ofereçam o benefício de maior sensibilidade experimental e não alterem as propriedades químicas de um nucleotídeo, os riscos potenciais à saúde decorrentes do trabalho com radioisótopos incentivaram o desenvolvimento da marcação de ácidos nucleicos não radioativos para fornecer uma alternativa mais segura para detecção de DNA e RNA 18,19,20. Dentre estes, a detecção de fluorescência, incluindo detecção direta de fluorescência, fluorescência resolvida no tempo e ensaios de transferência de energia/extinção de fluorescência se destacam como os mais versáteis 21,22,23,24. A extensa gama de fluoróforos permite diferentes designs de substratos de DNA / RNA com repórteres exclusivos em cada oligonucleotídeo²⁵. Além disso, a estabilidade dos fluoróforos, quando comparados aos radioisótopos, permite que os usuários produzam e preservem quantidades significativas de substratos de DNA marcados com fluorescência¹⁹. Esses substratos marcados com fluoróforo podem ser incubados com a proteína de interesse, juntamente com diferentes combinações de cofatores de metal e nucleotídeos, para analisar a ligação e/ou a atividade enzimática. A visualização da ligação ou atividade pode ser observada usando vários canais de corante de fluoróforo com um sistema de imagem em gel. Como apenas os oligonucleotídeos marcados com fluorescência serão visíveis usando esta técnica, qualquer aumento ou diminuição no tamanho do oligonucleotídeo marcado será fácil de seguir. Os géis também podem ser corados posteriormente, com corantes de coloração de ácido nucleico para visualizar todas as bandas de DNA presentes no gel.

As ligases de ácidos polinucléicos são enzimas que unem fragmentos de DNA/RNA, catalisando a vedação de quebras pela formação de uma ligação fosfodiéster entre os terminais de DNA fosforilados 5′ e o 3′ OH do DNA. Eles podem ser divididos em dois grupos de acordo com sua necessidade de substrato de nucleotídeos. As ligases dependentes de NAD altamente conservadas são encontradas em todas as bactérias²⁶, enquanto as enzimas dependentes de ATP estruturalmente diversas podem ser identificadas em todos os domínios da vida ^8,27. As DNA ligases desempenham um papel importante no processamento do fragmento de Okazaki durante a replicação, além de estarem envolvidas em várias vias de reparo do DNA, como o reparo por excisão de nucleotídeos e bases, por meio do selamento de cortes espontâneos e cortes que são deixados após o reparo ^8,10. Diferentes DNA ligases exibem capacidades variadas para unir diferentes conformações de quebras de DNA, incluindo cortes em um duplex, quebras de fita dupla, incompatibilidades e lacunas, bem como híbridos de RNA e DNA 28,29,30. Uma gama diversificada de substratos ligáveis pode ser montada por recozimento de oligonucleotídeos com um fosfato 5 ‘para gerar terminais justapostas de 5′ e 3’ em um duplex de ácido nucleico 31,32,33. O método de análise mais comum é a resolução por ureia PAGE em um formato de ensaio de ponto final; No entanto, inovações recentes incluíram o uso de eletroforese capilar em gel, que permite alto rendimento³⁴, perfil espectrométrico de massa³⁵, bem como um ensaio de farol molecular homogêneo, que permite o monitoramento resolvido no tempo³⁶.

O primeiro passo em uma reação de ligação é a adenilação da enzima ligase por trifosfato de adenosina (ATP) ou dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD), resultando em um intermediário enzimático covalente. A segunda etapa da reação é a adenilação do substrato de ácido nucleico na extremidade 5 ‘do local do corte, que é seguida pela ligação das fitas de ácido nucleico. Muitas enzimas ligase que são expressas recombinantemente em E. coli são purificadas na forma adenilada e, portanto, são capazes de ligar com sucesso ácidos nucléicos sem a adição de um cofator de nucleotídeo. Isso torna difícil determinar que tipo específico de cofator de nucleotídeo eles requerem para a ligação de ácidos nucléicos. Além de descrever ensaios para avaliar a atividade da DNA ligase, também é apresentado um método para determinar de forma confiável o uso de cofatores por meio da desadenilação da enzima usando substratos não marcados.

As nucleases são um grupo grande e diversificado de enzimas modificadoras de DNA / RNA e RNAs catalíticos que clivam as ligações fosfodiéster entre os ácidos nucléicos³⁷. As funcionalidades da enzima nuclease são necessárias na replicação, reparo e processamento de RNA do DNA e podem ser classificadas por sua especificidade de açúcar para DNA, RNA ou ambos. As endonucleases hidrolisam as ligações fosfodiéster dentro de uma fita de DNA / RNA, enquanto as exonucleases hidrolisam as fitas de DNA / RNA um nucleotídeo de cada vez a partir da extremidade 3 ‘ou 5’ e podem fazê-lo a partir da extremidade 3 ‘a 5’ ou 5 ‘a 3’ do DNA³⁸.

Embora muitas proteínas de nuclease sejam inespecíficas e possam estar envolvidas em vários processos, outras são altamente específicas para uma sequência específica ou dano ao DNA ^6,39,40. As nucleases específicas de sequência são usadas em uma ampla gama de aplicações biotecnológicas, como clonagem, mutagênese e edição de genoma. As nucleases populares para essas aplicações são nucleases de restrição⁴¹, nucleases de dedo de zinco⁴², nucleases efetoras semelhantes a ativadores transcricionais e, mais recentemente, as nucleases CRISPR projetadas guiadas por RNA⁴³. Nucleases específicas de dano foram recentemente identificadas, como a nuclease EndoMS, que tem especificidade para incompatibilidades no DNA por meio de seu domínio de nuclease semelhante a RecB específico para incompatibilidade ^5,44. Os ensaios de atividade da nuclease, historicamente, têm sido feitos como ensaios descontínuos com substratos radiomarcados; no entanto, além de suas outras desvantagens, elas não permitem a identificação do local que é cortado por uma proteína nuclease, o que é possível quando se utilizam substratos marcados com fluorescência^45,46. Mais recentemente, foram desenvolvidos ensaios de nuclease contínua que funcionam usando diferentes corantes de DNA que interagem com o DNA em diferentes estados; por exemplo, emitindo um sinal fluorescente mais alto ao interagir com o dsDNA do que em seu estado não ligado, ou ligando-se especificamente a RNAs curtos⁴⁷. Outros ensaios de nuclease contínua usam grampos de cabelo de DNA com um grupo fluoróforo na extremidade 5 ‘e um atenuador na extremidade 3’, de modo que a fluorescência aumenta à medida que o oligonucleotídeo é degradado devido a uma separação do fluoróforo e do atenuador⁴⁸. Embora esses ensaios permitam caracterizar a cinética das proteínas degradadoras do DNA, eles exigem conhecimento prévio da função e do substrato da enzima e também são limitados a enzimas que alteram a conformação do DNA para causar uma diferença na ligação do corante. Por esse motivo, os ensaios de endpoint que resolvem produtos de nuclease individuais ainda são desejáveis para fornecer informações sobre as modificações do DNA causadas pela atividade da proteína.

Aqui, um procedimento detalhado é apresentado para o projeto de oligonucleotídeos de DNA / RNA marcados com fluorescência que podem ser misturados e combinados para gerar substratos para testar a atividade de novas enzimas nuclease, polimerase e ligase. A validação deste conjunto básico de sequências de oligonucleotídeos simplifica o projeto experimental e facilita o perfil econômico de uma ampla gama de funcionalidades enzimáticas sem a necessidade de comprar um grande número de substratos sob medida. Um procedimento detalhado é fornecido para executar um ensaio enzimático de processamento de DNA padrão com esses substratos, usando o exemplo da atividade da DNA ligase e as modificações para testar e analisar as enzimas nuclease e polimerase são descritas. Além disso, um ensaio modificado para determinar a especificidade do cofator da enzima DNA ligase com alta precisão é fornecido, e sondas duplamente marcadas são usadas para avaliar a montagem de ligações multicomponentes. Finalmente, modificações no formato básico do ensaio são discutidas para permitir que ele seja usado para determinar as interações proteína-DNA com os mesmos substratos pelo ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA).