Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

Les détails des réactifs, des plasmides et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux. La composition des tampons utilisés est fournie dans le Fichier supplémentaire 1. 1. Préparation du plasmide Plasmides transformants (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) chez E. coli.REMARQUE : N’importe quelle souche d’E. coli peut être utilisée pour l’amplification plasmidique. Pour certains plasmides, des cellules compétentes spéciales telles que NEB stable peuvent améliorer le rendement plasmidique. Les trois plasmides utilisés dans ce protocole sont pAAV-GOI : pAAV-CMV-GFP, pHelper : pAdDeltaF6, et pAAV-Cap : pAAV-RC6. Cultivez des bactéries dans un milieu LB contenant les antibiotiques sélectifs appropriés dans un volume optimal à 37 °C pendant 16 à 18 h.REMARQUE : En cas d’utilisation de cellules stables NEB, cultiver à 30 °C pendant 18 à 20 h. Récoltez l’ADN plasmidique en centrifugeant E . coli. milieu de culture à 4000 x g, 4 °C, pendant 15 min. Versez avec précaution le liquide surnageant de la bouteille de centrifugation dans un récipient à déchets et purifiez l’ADN plasmidique de la pastille avec un kit de purification de plasmide sans endotoxines à grande échelle.REMARQUE : Assurez-vous de le verser lentement et d’éviter les éclaboussures. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.REMARQUE : Vérifiez la pureté de l’ADN en vérifiant le rapport OD260/OD280 . Le rapport pour l’ADN pur est d’environ 1,8. La concentration d’ADN doit être supérieure à 1 μg/μL pour l’étape de co-transfection ultérieure. Préparez des stocks de glycérol bactérien en ajoutant 500 μL de la culture de nuit à 500 μL de glycérol à 50 % dans un flacon cryogénique et conservez-les à -80 °C. 2. Préparation des cellules HEK293T Ensemez HEK293T cellules avec un milieu à haute teneur en glucose DMEM contenant 10 % de FBS dans une usine de cellules à 10 couches (CF10) et laissez les cellules se développer dans l’incubateur pendant la nuit.REMARQUE : Les passages des cellules 293T doivent être inférieurs à 10 pour avoir les conditions optimales pour une production robuste d’AAV. Si possible, n’ajoutez pas d’antibiotiques dans le milieu de culture pour le moment. CF10 a environ 42 fois la surface de croissance d’une boîte de culture cellulaire de 150 mm. Ensemencez la même densité cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 150 mm pour permettre de vérifier la croissance cellulaire au microscope. Préparez une suspension cellulaire de 1075 ml, ajoutez une suspension cellulaire de 25 ml dans un plat de 150 mm et ajoutez le reste dans le CF10. Vérifiez la confluence des cellules le lendemain avant la transfection.REMARQUE : Les cellules doivent atteindre une confluence de 80 à 90 % au moment de la transfection en observant au microscope. 3. Triple transfection des plasmides AAV Calculez la quantité de chaque plasmide nécessaire (pAAV-GOI, pHelper, sérotype pAAV) pour avoir un rapport molaire de 1,2 : 1:1 avec 2,5-5 mg d’ADN total par CF10.REMARQUE : Le rapport molaire des trois plasmides peut être variable pour une efficacité de transfection optimale. Il est préférable de le tester à petite échelle avant de passer à ce réglage CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 et pAAV-RC6 sont utilisés pour fabriquer le virus AAV6-CMV-GFP à titre d’exemple. La formule du calculateur de l’Île-du-Prince-Édouard est indiquée au tableau 1. Aliquote 350 mL d’OptiMEM dans un flacon stérile de 500 mL. Ajoutez les trois ADN plasmidiques dans la bouteille contenant l’Opti-MEM. Bien mélanger. Ajouter 15 mL d’une solution de polyéthylénimine (PEI) à 1 mg/mL (rapport ADN/μg d’ADN/μg PEI). Agitez vigoureusement le mélange OptiMEM/DNA/PEI de haut en bas pendant 30 s.REMARQUE : Il n’y a pas de mal à faire des bulles. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10-15 min.REMARQUE : Une incubation plus longue peut réduire l’efficacité de la transfection. Ajoutez la solution OptiMEM/DNA/PEI à la bouteille de 1 L contenant 700 mL de DMEM à faible teneur en glucose avec 10 mM d’HEPES et 2 % de FBS. Bien mélanger.REMARQUE : Dans cette étude, le faible taux de glucose dans le DMEM a montré une meilleure production de vecteurs AAV après co-transfection. L’ajout de HEPES aide à maintenir les cellules dans un meilleur état. Mélangez en tournant lentement la bouteille. Évitez de créer trop de bulles. Sortez le CF10 de l’incubateur et aspirez le média dans un conteneur à déchets.REMARQUE : Posez le CF10 sur la surface à l’intérieur du capot et soulevez progressivement un côté, aspirez lentement le support sans détacher les cellules. Ajoutez délicatement le mélange transfectant au CF10. Assurez-vous que les dix couches sont recouvertes de support.REMARQUE : Ajouter 25 ml de mélange transfectant dans le plat de 150 mm. Surveillez les cellules quotidiennement jusqu’à la récolte. Ajouter le reste du mélange transfectant dans le CF10 en versant lentement. Faites pivoter le CF10 très soigneusement et assurez-vous d’un volume égal pour chaque couche. Remettez le CF10 dans l’incubateur pendant 72 à 96 h.REMARQUE : Vérifiez la parabole du moniteur de 150 mm pour décider quand récolter les vecteurs AAV. Lorsque les cellules se détachent très facilement avec une charge complète d’AAV, il est temps de récolter. 4. Récolte des vecteurs AAV Récoltez le virus 3 à 4 jours après la transfection en secouant vigoureusement le CF10. Verser le milieu dans les tubes coniques de 250 mL et faire tourner le virus à 4000 x g pendant 20 min à 4 °C.REMARQUE : Pour le sérotype AAV6 utilisé dans ce protocole, 80 % des AAV resteront principalement liés au matériel cellulaire dans la cuffe. Et les 20 % d’AAV ont été dissimulés dans les médias. Ces proportions peuvent différer pour d’autres sérotypes AAV. Filtrez le surnageant clarifié avec une unité de filtration de 0,45 μm et conservez-le pour les précipitations. Rincez le CF10 avec 500 mL de tampon DPBS 1x et centrifugez-le à 4000 x g pendant 20 min à 4 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’un système de vide et d’une pipette d’aspiration. Ajouter 20 mL de tampon de lyse AAV par CF10 à -80 °C jusqu’à purification.REMARQUE : Transférez le lysat d’AAV dans un tube conique de 50 mL pour une extraction ultérieure de l’AAV. Retirer le surnageant filtré, ajouter une solution de NaCl 40 % de PEG-2,5 M pour une concentration finale de 8 % de PEG, et incuber dans une chambre froide sur un rotateur orbital pendant au moins 3 h ou toute la nuit.REMARQUE : Pour un surnageant de 100 mL, ajouter 25 mL de solution de NaCl PEG-2,5 M à 40 %. Précipiter le virus en le centrifugeant à 4000 x g pendant 30 min à 4 °C.REMARQUE : Transférer le mélange dans des tubes coniques de 250 ml pour la centrifugation. Aspirer pour éliminer le surnageant et ajouter 5 à 10 ml de tampon de remise en suspension AAV HEPES pour suspendre les granulés. Transvasez-le dans un tube conique de 50 mL pour poursuivre la purification en aval, ou stockez-le à -80 °C. 5. Extraction AAV Décongelez la pastille de virus dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 minutes avec un agitateur.REMARQUE : Vortex le lysat AAV pour fondre complètement. Congeler dans un bain 100% éthanol à -80 °C pendant 20-30 min.REMARQUE : Alternativement, le cycle de congélation peut être effectué avec un bécher froid 100% éthanol entouré de glace sèche. Effectuez la congélation/décongélation 3 à 4 fois et faites un tourbillon entre les deux si nécessaire.REMARQUE : Ce cycle peut être interrompu à l’étape de congélation. Stockez le lysat AAV à -80 °C jusqu’au travail en aval. Décongelez le lysat d’AAV (à partir de l’étape 5.3) et l’AAV à nouveau en suspension (à partir de l’étape 4.7) dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 minutes avec un agitateur, puis vortex.REMARQUE : Assurez-vous de fondre complètement et de le mélanger. Ajouter la nucléase de benzonase (250 unités/μL) au lysat d’AAV et à l’AAV remis en suspension pour une concentration finale de 50 unités/mL. Vortex la solution. Incuber au bain-marie à 37 °C en secouant pendant 30 min.REMARQUE : Retirez les aliquotes de désoxycholate de sodium à 10% dans un bain-marie pour laisser le temps de se dissoudre, de se réchauffer et de bien mélanger. Ajouter du désoxycholate de sodium à 10 % pour une concentration finale de 0,5 % et incuber à 37 °C avec un agitateur pendant 30 min.REMARQUE : Le désoxycholate de sodium a été utilisé pour améliorer la libération d’AAV par les cellules. Répartir la solution brute d’AAV dans des tubes à centrifuger de 2 mL et centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Transvasez le surnageant dans un tube conique de 50 ml.REMARQUE : À l’aide d’une pipette de 1 ml, transférez le surnageant. Jetez les granulés. Ajouter une quantité égale de chloroforme et extraire l’AAV en tourbillonnant pendant 1 à 2 min.REMARQUE : La solution doit devenir opaque, blanche, comme du lait. Transférez la solution lactée dans des tubes à centrifuger de 2 ml et répartissez-la uniformément. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Pipetez soigneusement la couche rose supérieure et transférez-la dans un nouveau tube conique de 50 ml.REMARQUE : Ne dérangez pas les couches de chloroforme/protéines. Mesurez le volume final à l’aide d’une pipette. Selon le tableau des volumes bruts AAV-PEG-Sulfate (tableau 2), mélanger les volumes appropriés de 50 % (NH4)2SO4 et de 40 % de solution PEG. Vortex pendant 2 min. Transférer le mélange dans des tubes à centrifuger de 2 mL pour répartir uniformément. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C Prélever la couche inférieure à l’aide d’une aiguille de 22 g et d’une seringue de 3 ml. Prélever l’AAV dans un tube conique de 50 mL et le stocker à 4 °C pour une ultracentrifugation ultérieure des gradients d’iodixanol. 6. Purification AAV par ultracentrifugation par gradient d’iodixanol Préparez les gradients d’iodixanol fraîchement avant de charger l’AAV en fonction du nombre de tubes d’ultracentrifugation utilisés (tableau 3).REMARQUE : Du rouge de phénol a été utilisé pour observer les couches. Recouvrez lentement chaque solution dans un tube à fermeture rapide en polypropylène à bouchon rond à l’aide d’une seringue de 10 ml fixée à l’aide d’une aiguille longue de 16 g. Évitez les bulles. Ajouter délicatement jusqu’à 17 ml de solution d’AAV sur le dessus du gradient avec une seringue de 22 G. Utilisez un tampon de dialyse AAV pour remplir le tube.REMARQUE : Ajoutez la solution AAV en chargeant les gouttes contre la paroi dans le tube de l’ultracentrifugeuse. Ne dérangez pas les couches de dégradé. Scellez les tubes d’ultracentrifugation avec une soudeuse électrique.REMARQUE : Équilibrez les tubes avant de les envoyer à l’ultracentrifugeuse avec une différence de ±0,2 g. Centrifugeuse à 350 000 x g pendant 2 h dans un rotor Ti70 à 4 °C. Retirez délicatement les tubes du rotor et placez-les dans le rack des tubes d’ultracentrifugation.REMARQUE : Assurez-vous que les pentes ne sont pas perturbées. Collectez les fractions AAV en suivant les étapes ci-dessous :Stabilisez le tube sur un support de support. Percez les tubes de l’ultracentrifugeuse légèrement en dessous de l’interface 40 %-60 % avec une aiguille de 19 G attachée à une seringue de 10 ml.REMARQUE : L’ouverture de l’aiguille doit être vers le haut, face à la pente de 40%. Percez un trou dans le haut du tube avec une aiguille de 16 G. Recueillir jusqu’à 5 ml par tube. Évitez de collecter la contamination protéique à l’interface 25 %-40 %. Répétez l’opération pour chaque tube d’ultracentrifugation.REMARQUE : Transférez les fractions AAV dans un tube conique de 50 ml. 7. Ultracentrifugation des gradients d’iodixanol du deuxième tour REMARQUE : Cette étape est facultative. Cette étape consiste à réduire le rapport AAV vide pour une capside AAV complète de meilleure qualité. Diluer l’AAV >1:1 avec un tampon de dialyse AAV.REMARQUE : L’AAV recueilli lors de la première série d’ultracentrifugation était à 40 % de couche d’iodixanol. Il doit être dilué à au moins 50 % pour pouvoir être chargé sur la couche d’iodixanol à 30 %. Superposer chaque solution (tableau 4) dans un tube d’ultracentrifugation à l’aide d’une aiguille de 16 G et fixer lentement une seringue de 10 mL. Évitez les bulles. Ajouter délicatement 20 ml de solution d’AAV diluée sur le gradient à l’aide d’une seringue de 22 G. Utilisez un tampon de dialyse AAV pour remplir le tube. Répétez les étapes 6.4 à 6.7. 8. Dialyse AAV et concentration Transférez le virus AAV dans la cassette de dialyse à l’aide d’une aiguille neuve de 18 G et d’une seringue de 10 ml. Injectez lentement le virus dans la cassette et retirez-en l’air. Ajoutez une barre d’agitation dans le bécher contenant un tampon de dialyse AAV et placez-la sur une plaque d’agitation. Insérez la cassette de dialyse dans le tampon de dialyse à l’aide d’une bouée à flotteur. Remuez à 4 °C. Changez 2 à 3 fois le tampon de dialyse AAV.REMARQUE : Utilisez suffisamment de tampon pour permettre à la cassette de flotter et effectuez le remplacement de tampon. Couvrez le bécher de papier d’aluminium. À l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’une aiguille de 18 G, recueillir le virus de la cassette dans une unité de filtration centrifuge. Centrifugeuse à 4 000 x g pendant 15 à 30 min à 4 °C.REMARQUE : Rincez l’AAV avec le tampon de dialyse AAV 2-3 fois. Concentrez l’AAV jusqu’à ce que ~200 μL de liquide restant se trouvent sur le dessus du filtre. Récupérez l’AAV concentré de l’unité de filtration. Rincez le filtre avec 300 μL supplémentaires de tampon de dialyse AAV et transférez-le dans l’AAV concentré. Filtrez le virus à travers un filtre de seringue de 0,22 μm à l’aide d’une seringue à lamelle Luer Slip de tuberculine de 1 mL. Pour assurer le moins de perte de volume possible, utilisez la seringue de 10 ml pour pousser l’air à travers le filtre 2 à 3 fois. Conservez le virus AAV purifié à 4 °C temporellement pour le titrage.REMARQUE : Titrez le virus, aliquote et conservez-le à -80 °C dans un délai de 1 semaine. 9. Titrage du virus AAV REMARQUE : La réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) de TaqMan a été utilisée pour titrer l’AAV purifié. Traiter les vecteurs AAV avec de la DNase I et incuber à 37 °C pendant 30 min, puis incuber à 95 °C pendant 10 min.REMARQUE : À titre d’exemple de réaction de 10 μL, 2 μL d’échantillon de virus AAV, 1 μL de DNase, 1 μL de tampon DNase et 6 μLde H 2O sont utilisés. Il peut être réalisé dans un thermocycleur avec des tubes PCR. Préparez les jeux d’amorces ciblant la zone d’insertion AAV.REMARQUE : Les cibles pourraient être le promoteur, le transgène et le rapporteur dans la construction AAV. Les amorces sont énumérées dans le tableau 5. Préparez des étalons de plasmide d’ADN (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 et 0,0001 pg/μL) et un témoin négatif (H2O). Préparez le master mix qPCR, y compris les amorces, conformément aux instructions du fabricant. Placez les étalons et les échantillons en trois exemplaires sur une plaque PCR. Ajoutez le mélange qPCR dans les étalons et les échantillons. Fermez la plaque et effectuez la réaction qPCR conformément aux instructions du fabricant.REMARQUE : Les conditions de réaction dépendent des matériaux/réactifs et de l’instrument. Des cycles PCR rapides et conventionnels sont applicables. Calculer le titre du virus AAV.REMARQUE : La concentration de l’échantillon dans ce protocole est de 1/10 de dilution par rapport aux échantillons d’origine. Aliquote le virus AAV dans des tubes de 1,5 mL et conserver à 4 °C pendant un mois au maximum et à -80 °C à long terme.REMARQUE : Évitez les cycles de gel/dégel pour le stockage. Lorsqu’il est utilisé pour des expériences in vivo , ne pas utiliser de décongélation sur deux aliquotes. 10. Contrôle de la qualité de l’AAV REMARQUE : La pureté des virus AAV a été caractérisée par coloration à l’argent SDS-PAGE à l’aide d’un gel SDS-PAGE et colorée à l’aide d’un kit de coloration disponible dans le commerce. Dénaturer 3 x 109 vg d’échantillon de virus AAV avec tampon Laemmli.REMARQUE : Utilisez un virus AAV de référence comme contrôle. La capside complète de référence AAV6-CMV-GFP est utilisée. Chargez l’AAV dénaturé sur un gel SDS-PAGE à gradient de 4 % à 20 % et faites-le fonctionner à 180 V pendant 50 min. Retirez le gel de la plaque d’électrophorèse. Teindre le gel avec un kit de coloration à l’argent selon les instructions du fabricant. Vérifiez les protéines de capside AAV VP1, VP2 et VP3.REMARQUE : Le virus AAV pur ne contient que les protéines de capside VP1, VP2 et VP3. S’ils ne sont pas purs, d’autres bandes de protéines seraient visibles sur le gel.REMARQUE : La microscopie électronique à transmission (MET) de virions AAV recombinants colorés négativement a été réalisée pour évaluer l’intégrité morphologique et le rapport plein/vide. Prenez une grille EM à l’aide d’une pince à épiler et posez-la sur le banc avec le côté brillant de la grille vers le haut. Placez 5 μL d’échantillon AAV sur la grille et laissez-le sécher par évaporation.REMARQUE : Diluez l’AAV si nécessaire. 1012 vg/mL est un titre moyen. Cela peut prendre 30 à 60 minutes pour sécher la grille. Lavez la grille par pipetage, goutte à goutte, avec environ 200 μL de H2O sur la grille. Retirez l’excès d’eau en plaçant lentement un papier de chromatographie verticalement à côté de la grille. Pipeter 5 μL de solution d’acétate d’uranyle à 2 % sur la grille. Incuber pendant 5 min et retirer la mèche comme mentionné ci-dessus. Laissez sécher la grille. Visualisez les particules AAV au microscope électronique à transmission (à un grossissement de 50 000 fois). Les capsides virales avec un génome viral apparaîtront comme des hexagones blancs homogènes, tandis que les capsides vides apparaîtront comme des hexagones avec un bord blanc mais un centre sombre. Comptez au hasard au moins 100 particules pour déterminer le pourcentage approximatif de pleins vs. particules AAV vides.