Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

Os detalhes dos reagentes, plasmídeos e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais. A composição dos buffers usados é fornecida no Arquivo Suplementar 1. 1. Preparação do plasmídeo Plasmídeos de transformação (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) em E. coli.NOTA: Qualquer cepa de E.coli pode ser usada para amplificação de plasmídeo. Para alguns plasmídeos, células competentes especiais, como NEB estável, podem melhorar o rendimento do plasmídeo. Os três plasmídeos usados neste protocolo são pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 e pAAV-Cap: pAAV-RC6. Cultivar bactérias em meio LB contendo os antibióticos seletivos apropriados em volume ideal a 37 °C por 16-18 h.NOTA: Ao usar células estáveis NEB, cultive a 30 ° C por 18-20 h. Colha DNA de plasmídeo centrifugando a E. coli. meio de cultura a 4000 x g, 4 °C, durante 15 min. Despeje cuidadosamente o líquido sobrenadante do frasco da centrífuga em um recipiente de resíduos e purifique o DNA do plasmídeo do pellet com um kit de purificação de plasmídeo livre de endotoxinas em grande escala.NOTA: Certifique-se de despejá-lo lentamente e evitar respingos. Meça a concentração e a pureza do DNA usando um espectrofotômetro.NOTA: Verifique a pureza do DNA verificando a proporção OD260 / OD280 . A proporção para DNA puro é de cerca de 1,8. A concentração de DNA deve estar acima de 1 μg/μL para a etapa posterior de co-transfecção. Faça estoques de glicerol bacteriano adicionando 500 μL da cultura durante a noite a 500 μL de glicerol a 50% em um criovírus e armazene a -80 ° C. 2. Preparando células HEK293T Semeie células HEK293T com meio DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de FBS em uma fábrica de células de 10 camadas (CF10) e deixe as células crescerem na incubadora durante a noite.NOTA: As passagens das células 293T devem ser inferiores a 10 para ter a condição ideal para uma produção robusta de AAV. Se possível, não adicione antibióticos aos meios de cultura neste momento. O CF10 tem aproximadamente 42 vezes a área de superfície de crescimento de uma placa de cultura de células de 150 mm. Semear a mesma densidade celular numa placa de cultura de células de 150 mm para permitir a verificação do crescimento celular ao microscópio. Prepare a suspensão de células de 1075 mL, adicione a suspensão de células de 25 mL a um prato de 150 mm e adicione o restante ao CF10. Verifique a confluência celular no dia seguinte antes da transfecção.NOTA: As células devem atingir 80% -90% de confluência no momento da transfecção, observando ao microscópio. 3. Transfecção tripla de plasmídeos AAV Calcule a quantidade de cada plasmídeo necessária (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-sorotype) para ter uma proporção molar de 1,2: 1: 1 com 2,5-5 mg de DNA total por CF10.NOTA: A razão molar dos três plasmídeos pode ser variável para a eficácia ideal da transfecção. É melhor testá-lo em uma configuração de pequena escala antes de passar para essa configuração CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 e pAAV-RC6 são usados para fazer o vírus AAV6-CMV-GFP como exemplo. A fórmula da calculadora PEI está listada na Tabela 1. Alíquota de 350 mL de OptiMEM em um frasco estéril de 500 mL. Adicione todos os três DNA de plasmídeo ao frasco que contém o Opti-MEM. Misture bem. Adicionar 15 ml de solução de polietilenimina (PEI) a 1 mg/ml (proporção de 1:3 μg de ADN para μg de PEI). Agite a mistura OptiMEM/DNA/PEI para cima e para baixo vigorosamente por 30 s.NOTA: Não há problema em fazer bolhas. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10-15 min.NOTA: Uma incubação mais longa pode reduzir a eficiência da transfecção. Adicione a solução OptiMEM/DNA/PEI ao frasco de 1 L contendo 700 mL de DMEM de baixa glicose com 10 mM de HEPES e 2% de FBS. Misture bem.NOTA: Neste estudo, a baixa glicose no DMEM mostrou melhor produção do vetor AAV após a co-transfecção. A adição de HEPES ajuda a manter as células em melhores condições. Misture girando a garrafa lentamente. Evite criar muitas bolhas. Retire o CF10 da incubadora e aspire o meio para um recipiente de resíduos.NOTA: Coloque o CF10 na superfície dentro do exaustor e levante gradualmente um lado para cima, aspire lentamente a mídia sem soltar as células. Adicione cuidadosamente a mistura transfectante ao CF10. Certifique-se de que todas as dez camadas estejam cobertas com mídia.NOTA: Adicione 25 mL de mistura transfectante no prato de 150 mm. Monitore as células diariamente até a colheita. Adicione a mistura transfectante restante ao CF10 despejando lentamente. Gire o CF10 com muito cuidado e garanta um volume igual para cada camada. Devolva o CF10 à incubadora por 72-96 h.NOTA: Verifique o prato do monitor de 150 mm para decidir quando colher os vetores AAV. Quando as células se desprendem facilmente com uma carga total de AAV, é hora de colher. 4. Colheita de vetores AAV Colha o vírus 3-4 dias após a transfecção, agitando o CF10 vigorosamente. Despeje o meio nos tubos cônicos de 250 mL e gire o vírus a 4000 x g por 20 min a 4 ° C.NOTA: Para o sorotipo AAV6 usado neste protocolo, 80% do AAV permanecerá principalmente ligado ao material celular no pellet. E os 20% de AAV foram secretados na mídia. Essas proporções podem diferir para outros sorotipos de AAV. Filtre o sobrenadante clarificado com unidade de filtro de 0,45 μm e guarde-o para precipitação. Enxágue o CF10 com 500 mL de tampão DPBS 1x e centrifugue a 4000 x g por 20 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo e uma pipeta de aspiração. Adicionar 20 ml de tampão de lise de AAV por CF10 a -80 °C até à purificação.NOTA: Transfira o lisado de AAV para um tubo cônico de 50 mL para posterior extração de AAV. Retire o sobrenadante filtrado, adicione 40% de solução de NaCl PEG-2,5 M para uma concentração final de 8% de PEG e incube em uma câmara fria em um rotador orbital por pelo menos 3 h ou durante a noite.NOTA: Para 100 mL de sobrenadante, adicione 25 mL de solução de NaCl PEG-2,5 M a 40%. Precipitar o vírus centrifugando a 4000 x g durante 30 min a 4 °C.NOTA: Transfira a mistura para tubos cônicos de 250 mL para centrifugação. Aspire para remover o sobrenadante e adicione 5-10 mL de tampão de ressuspensão AAV HEPES para suspender os pellets. Transfira para um tubo cônico de 50 mL para continuar a purificação a jusante ou armazene-o a -80 °C. 5. Extração de AAV Descongele o pellet de vírus em banho-maria a 37 °C por 10-15 min com um shaker.NOTA: Vortex o lisado AAV para derreter completamente. Congelar em banho de etanol 100% a -80 °C por 20-30 min.NOTA: Alternativamente, o ciclo de congelamento pode ser feito com um béquer frio 100% etanol cercado por gelo seco. Execute congelamento/descongelamento 3-4 vezes e vórtice no meio, se necessário.NOTA: Este ciclo pode ser pausado na etapa de congelamento. Conservar o lisado de AAV a -80 °C até ao trabalho a jusante. Descongelar o lisado de AAV (a partir do passo 5.3) e o AAV ressuspenso (do passo 4.7)” num banho-maria a 37 °C durante 10-15 min com um agitador e vórtice.NOTA: Certifique-se de derreter completamente e misture. Adicione a nuclease da benzonase (250 unidades / μL) ao lisado de AAV e o AAV ressuspenso para uma concentração final de 50 unidades / mL. Vortex a solução. Incubar em banho-maria a 37 °C com agitação durante 30 min.NOTA: Retire as alíquotas de desoxicolato de sódio a 10% em banho-maria para dar tempo de dissolver, aquecer e misturar bem. Adicione 10% de desoxicolato de sódio para uma concentração final de 0,5% e incube a 37 °C com um agitador ligado por 30 min.NOTA: O desoxicolato de sódio foi usado para aumentar a liberação de AAV das células. Distribua a solução bruta de AAV em tubos de centrífuga de 2 mL e centrifugue a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mL.NOTA: Use uma pipeta de 1 mL para transferir o sobrenadante. Descarte os pellets. Adicione uma quantidade igual de clorofórmio e extraia AAV por vórtice por 1-2 min.NOTA: A solução deve tornar-se opaca, branca, semelhante ao leite. Transfira a solução leitosa para tubos de centrífuga de 2 mL e distribua uniformemente. Centrifugue a 14.000 x g por 10 min a 4 °C. Pipetar cuidadosamente a camada rosa superior e transferi-la para um novo tubo cónico de 50 ml.NOTA: Não perturbe as camadas de clorofórmio/proteína. Meça o volume final usando uma pipeta. De acordo com a tabela de volume bruta de AAV-PEG-Sulfato (Tabela 2), misture volumes apropriados de 50% (NH4)2SO4 e solução de PEG a 40%. Vórtice por 2 min. Transfira a mistura para tubos de centrífuga de 2 mL para distribuir uniformemente. Centrifugue a 14.000 x g por 10 min a 4 °C Recolha a camada inferior utilizando uma agulha de 22 G e uma seringa de 3 ml. Colete o AAV em um tubo cônico de 50 mL e armazene-o a 4 ° C para posterior ultracentrifugação com gradientes de iodixanol. 6. Purificação de AAV por ultracentrifugação de gradiente de iodixanol Preparar os gradientes de iodixanol de novo antes de carregar o AAV de acordo com o número de tubos de ultracentrifugação utilizados (Quadro 3).NOTA: O vermelho de fenol foi usado para observar as camadas. Sobreponha cada solução em um tubo de vedação rápida de ultracentrífuga de polipropileno de topo redondo lentamente usando uma seringa de 10 mL conectada com uma agulha longa puntada de 16 G. Evite bolhas. Adicione cuidadosamente até 17 mL de solução de AAV no topo do gradiente com uma seringa de 22 G. Use tampão de diálise AAV para completar o tubo.NOTA: Adicione a solução AAV carregando gotas contra a parede no tubo da ultracentrífuga. Não perturbe as camadas de gradiente. Sele os tubos da ultracentrífuga com um selador elétrico.NOTA: Equilibre os tubos antes de enviá-los para a ultracentrífuga com ±0,2 g de diferença. Centrifugar a 350.000 x g durante 2 h num rotor Ti70 a 4 °C. Remova cuidadosamente os tubos do rotor e coloque-os no rack de tubos da ultracentrífuga.NOTA: Certifique-se de que os gradientes não sejam perturbados. Colete as frações AAV seguindo as etapas abaixo:Estabilize o tubo em um suporte. Perfure os tubos da ultracentrífuga ligeiramente abaixo da interface de 40% a 60% com uma agulha de 19 G conectada a uma seringa de 10 mL.NOTA: A abertura da agulha deve estar voltada para cima, voltada para o gradiente de 40%. Faça um furo na parte superior do tubo com uma agulha de 16 G. Colete até 5 mL por tubo. Evite coletar a contaminação da proteína na interface de 25% a 40%. Repita para cada tubo de ultracentrífuga.NOTA: Transfira as frações AAV para um tubo cônico de 50 mL. 7. Ultracentrifugação de gradientes de iodixanol de segunda rodada NOTA: Esta etapa é opcional. Esta etapa é para reduzir a proporção de AAV vazio para um capsídeo AAV completo de maior qualidade. Dilua o AAV >1:1 com tampão de diálise AAV.NOTA: O AA Deve ser diluído em pelo menos 50% para poder ser carregado sobre a camada de 30% de iodixanol. Cubra cada solução (Tabela 4) em um tubo de ultracentrifugação usando uma agulha puntada de 16 G e coloque lentamente uma seringa de 10 mL. Evite bolhas. Adicione cuidadosamente 20 mL de solução diluída de AAV no topo do gradiente com uma seringa de 22 G. Use tampão de diálise AAV para completar o tubo. Repita as etapas 6.4 a 6.7. 8. Diálise e concentração de AAV Transfira o vírus AAV para o de diálise usando uma nova agulha de 18 G e uma seringa de 10 mL. Injete lentamente o vírus no e remova o ar dele. Adicione uma barra de agitação ao copo contendo tampão de diálise AAV e coloque-a em uma placa de agitação. Coloque o de diálise no tampão de diálise com uma bóia flutuante. Agitar a 4 °C. Troque 2-3 vezes o tampão de diálise AAV.NOTA: Use buffer suficiente para permitir que o flutue e execute a troca de buffer. Cubra o copo com papel alumínio. Usando uma seringa de 10 mL acoplada a uma agulha de 18 G, colete o vírus do para uma unidade de filtro centrífugo. Centrifugue a 4.000 x g por 15-30 min a 4 °C.NOTA: Limpe o AAV com tampão de diálise AAV 2-3 vezes. Concentre o AAV até que ~ 200 μL restantes estejam no topo do filtro. Colete o AAV concentrado da unidade de filtro. Enxágue o filtro com mais 300 μL de tampão de diálise AAV e transfira-o para o AAV concentrado. Filtre o vírus através de um filtro de seringa de 0,22 μm usando uma seringa de tuberculina luer slip de 1 mL. Para garantir a menor quantidade de perda de volume, use a seringa de 10 mL para empurrar o ar através do filtro 2-3 vezes. Conservar temporariamente o vírus AAV purificado a 4 °C para titulação.NOTA: Titular o vírus, alíquota e armazenar a -80 °C dentro de 1 semana. 9. Titulação do vírus AAV NOTA: A reação em cadeia da polimerase quantitativa TaqMan (qPCR) foi usada para titular o AAV purificado. Trate os vetores AAV com DNase I e incube a 37 °C por 30 min, depois incube a 95 °C por 10 min.NOTA: Como exemplo de reação de 10 μL, 2 μL de amostra de vírus AAV, 1 μL de DNase, 1 μL de tampão DNase e 6 μL H2O são usados. Pode ser realizado em termociclador com tubos de PCR. Prepare os conjuntos de primers direcionados à região de inserção do AAV.NOTA: Os alvos podem ser o promotor, o transgene e o repórter na construção AAV. Os primers estão listados na Tabela 5. Preparar padrões de plasmídeos de ADN (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 e 0,0001 pg/μL) e um controlo negativo (H2O). Prepare a mistura principal de qPCR, incluindo primers, de acordo com as instruções do fabricante. Colocar os padrões e as amostras em triplicado numa placa PCR. Adicione a mistura de qPCR aos padrões e amostras. Sele a placa e execute a reação qPCR de acordo com as instruções do fabricante.NOTA: As condições de reação dependem dos materiais/reagentes e do instrumento. Ciclos de PCR rápidos e convencionais são aplicáveis. Calcule o título do vírus AAV.NOTA: A concentração da amostra neste protocolo é de 1/10 de diluição das amostras originais. Aliquotar o vírus AAV em tubos de 1,5 mL e armazenar a 4 °C por até um mês e armazenar a -80 °C a longo prazo.NOTA: Evite ciclos de congelamento/descongelamento para o armazenamento. Quando usado para experimentos in vivo , não use descongelar duas alíquotas. 10. Controle de qualidade do AAV NOTA: Os vírus AAV foram caracterizados quanto à pureza pela coloração de prata SDS-PAGE usando um gel SDS-PAGE e corados usando um kit de coloração disponível comercialmente. Desnature 3 x 109 vg da amostra de vírus AAV com tampão Laemmli.NOTA: Use um vírus AAV de referência como controle. O capsídeo completo de referência AAV6-CMV-GFP é usado. Carregue o AAV desnaturado em um gel SDS-PAGE com gradiente de 4% a 20% e opere a 180 V por 50 min. Remova o gel da placa de eletroforese. Pinte o gel com um kit de coloração de prata de acordo com as instruções do fabricante. Verifique as proteínas do capsídeo AAV VP1, VP2 e VP3.NOTA: O vírus AAV puro contém apenas a proteína do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Se não for puro, outras bandas de proteína seriam visíveis no gel.NOTA: A microscopia eletrônica de transmissão (MET) de vírions AAV recombinantes corados negativamente foi realizada para avaliar a integridade morfológica e a relação cheio/vazio. Pegue uma grade EM com uma pinça e coloque-se no banco com o lado brilhante da grade voltado para cima. Pipetar 5 μL de amostra de AAV na grelha e deixá-la secar por evaporação.NOTA: Dilua o AAV, se necessário. 1012 vg/mL é um título médio. Pode levar de 30 a 60 minutos para secar a grade. Lave a grelha pipetando, gota a gota, com cerca de 200 μL de H2O na grelha. Remova o excesso de água colocando lentamente um papel de cromatografia verticalmente ao lado da grade. Pipetar 5 μL de solução de acetato de uranilo a 2% na grade. Incube por 5 min e retire a umidade conforme mencionado acima. Deixe a grade secar. Visualize as partículas AAV sob um microscópio eletrônico de transmissão (com ampliação de 50.000 vezes). Os capsídeos virais com genoma viral aparecerão como hexágonos brancos homogêneos, enquanto os capsídeos vazios aparecerão como hexágonos com uma borda branca, mas um centro escuro. Conte aleatoriamente pelo menos 100 partículas para determinar a porcentagem aproximada de cheio vs. partículas AAV vazias.