Cell Factory Platformを利用した高力価で高品質なアデノ随伴ウイルスベクターを生成するための合理化および標準化された手順

本試験で使用した試薬、プラスミド、および機器の詳細は、 材料表に記載されています。使用されるバッファーの構成は、 補足ファイル 1 に記載されています。 1. プラスミドの調製 プラスミド(pAAV-GOI、pHelper、pAAV-Cap)を 大腸菌で形質転換します。注:プラスミド増幅には、任意の 大腸菌 株を使用することができます。一部のプラスミドでは、NEB stableなどの特殊なコンピテントセルがプラスミドの収量を向上させることができます。このプロトコルで使用される3つのプラスミドは、pAAV-GOI:pAAV-CMV-GFP、pHelper:pAdDeltaF6、およびpAAV-Cap:pAAV-RC6です。 適切な選択的抗生物質を含むLB培地で、37°Cで16〜18時間、最適な量で細菌を増殖させます。注:NEB安定細胞を使用する場合は、30°Cで18〜20時間培養してください。 大腸菌を遠心分離してプラスミドDNAを回収します。培地を4000 x g、4°C、15分間保存します。 遠心分離ボトルから上清液を廃棄物容器に慎重に注ぎ、大規模なエンドトキシンフリープラスミド精製キットでペレットからプラスミドDNAを精製します。注意: 水しぶきを避けてゆっくりと注ぐようにしてください。 分光光度計を使用してDNA濃度と純度を測定します。注:OD260/OD280 比をチェックして、DNAの純度を確認してください。純粋なDNAの比率は約1.8です。DNA濃度は、後のコトランスフェクションステップで1 μg/μL以上である必要があります。クライオバイアル中の500 μLの50%グリセロールに500 μLの一晩培養液を加えてバクテリアのグリセリンストックを作製し、-80 °Cで保存します。 2. HEK293T細胞の準備 10Sを含むDMEM高グルコース培地でHEK293T細胞を10層細胞工場(CF10)に播種し、細胞をインキュベーターで一晩成長させます。注:293Tセルの継代は、堅牢なAAV生産に最適な条件を得るためには、10未満である必要があります。可能であれば、この時点では培地に抗生物質を追加しないでください。CF10は、150 mmの細胞培養皿の約42倍の増殖表面積を持っています。150 mmの細胞培養皿に同じ細胞密度を播種して、顕微鏡で細胞の成長を確認できるようにします。1075 mLの細胞懸濁液を調製し、25 mLの細胞懸濁液を150 mmのディッシュに加え、残りをCF10に加えます。 トランスフェクションの翌日に細胞の密度を確認してください。注:細胞は、顕微鏡で観察することにより、トランスフェクション時に80%〜90%のコンフルエントに達するはずです。 3. AAVプラスミドのトリプルトランスフェクション CF10あたり2.5〜5 mgの総DNAで1.2:1:1のモル比を持つために必要な各プラスミド(pAAV-GOI、pHelper、pAAV-血清型)の量を計算します。注:3つのプラスミドのモル比は、最適なトランスフェクション効果を得るために変動する可能性があります。このCF10の設定に移行する前に、小規模な設定でテストすることをお勧めします。例として、pAAV-CMV-GFP、pAdDeltaF6、およびpAAV-RC6を使用してAAV6-CMV-GFPウイルスを作成します。PEI 計算機の式を 表 1 に示します。 350 mLのOptiMEMを滅菌済みの500 mLボトルに分注します。 Opti-MEMの入ったボトルに3つのプラスミドDNAをすべて加えます。よく混ぜます。 1 mg/mL ポリエチレンイミン(PEI)溶液 15 mL (1:3 μg の DNA と μg の PEI 比) を加えます。OptiMEM/DNA/PEI混合物を上下に激しく30秒間振とうします。注:泡を作っても大丈夫です。 混合物を室温で10〜15分間インキュベートします。注:インキュベーションが長くなると、トランスフェクション効率が低下する可能性があります。 OptiMEM/DNA/PEI溶液を、10 mM HEPESおよび2% FBSを含む700 mLのDMEM低グルコースを含む1 Lボトルに加えます。よく混ぜます。注:この研究では、DMEM中の低グルコースは、同時トランスフェクション後のAAVベクター産生が良好であることを示しました。HEPESの添加は、細胞をより良い状態に保つのに役立ちます。ボトルをゆっくりと回転させて混ぜます。バブルをたくさん作らないようにしましょう。 CF10をインキュベーターから取り出し、メディアを真空にして廃棄物容器に入れます。注意: CF10をフードの内側の表面に置き、片側を徐々に上に持ち上げ、セルを取り外しずにゆっくりとメディアを真空にします。 トランスフェクタント混合物をCF10に慎重に加えます。10 層すべてがメディアで覆われていることを確認します。注:25 mLのトランスフェクタント混合物を150 mmの皿に加えます。収穫まで毎日細胞を監視します。残りのトランスフェクタント混合物をゆっくりと注いでCF10に加えます。CF10を慎重に回転させ、各レイヤーの体積が等しくなるようにします。 CF10をインキュベーターに72〜96時間戻します。注意: 150 mmモニターディッシュをチェックして、AAVベクターをいつ収穫するかを決定します。AAVの全負荷で細胞が非常に簡単に剥離するようになったら、収穫の時期です。 4. AAVベクターの採取 トランスフェクションの3〜4日後に、CF10を激しく振ってウイルスを採取します。培地を250 mLのコニカルチューブに注ぎ、ウイルスを4000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。注:このプロトコルで使用されるAAV6血清型の場合、80%のAAVはペレット内の細胞物質にほとんど結合したままになります。そして、20%のAAVはメディアに隠されました。これらの割合は、他のAAV血清型では異なる場合があります。 0.45 μmのフィルターユニットで上清を清澄化し、沈殿用に保存します。 CF10を500 mLのDPBS 1xバッファーですすぎ、4000 x gで4000 x g 、4°Cで20分間遠心分離します。 真空システムと吸引ピペットを使用して上清を捨てます。精製するまで、CF10あたり20 mLのAAV溶解バッファーを-80°Cで加えます。注:AAVライセートを50 mLコニカルチューブに移し、後でAAVを抽出します。 ろ過した上清を取り出し、40% PEG-2.5 M NaCl溶液を添加して最終濃度8% PEGにし、軌道回転子の冷蔵室で少なくとも3時間または一晩インキュベートします。注:100 mLの上清には、25 mLの40%PEG-2.5 M NaCl溶液を加えます。 4000 x g で4°Cで30分間遠心分離することにより、ウイルスを沈殿させます。注:遠心分離のために混合物を250mLコニカルチューブに移します。 吸引して上清を除去し、5〜10 mLのAAV HEPES再懸濁緩衝液を加えてペレットを懸濁します。50 mLのコニカルチューブに移して下流の精製を続けるか、-80°Cで保存します。 5. AAV抽出 ウイルスペレットを37°Cの水浴でシェーカーで10〜15分間解凍します。注:AAVライセートをボルテックスして完全に溶融します。 -80°Cの100%エタノール浴で20〜30分間凍結します。注:あるいは、凍結サイクルは、ドライアイスに囲まれた冷たい100%エタノールビーカーで行うことができます。 凍結/解凍を3〜4回行い、必要に応じてその間に渦巻きます。注意: このサイクルは、フリーズステップで一時停止できます。AAVライセートは、下流の作業まで-80°Cで保存します。 AAVライセート(ステップ5.3から)と再懸濁AAV(ステップ4.7から)を37°Cの水浴でシェーカーを使用して10〜15分間解凍し、ボルテックスします。注意: 完全に溶けて混ぜることを確認してください。 ベンゾナーゼヌクレアーゼ(250ユニット/μL)をAAVライセートに添加し、AAVを再懸濁して最終濃度を50ユニット/mLにします。解決策をボルテックスします。 37°Cの水浴で30分間振とうしながらインキュベートします。注:10%デオキシコール酸ナトリウムアリコートを水浴で取り出して、溶解し、ウォームアップし、完全に混合する時間を確保します。 10%デオキシコール酸ナトリウムを添加して最終濃度を0.5%にし、シェーカーをつけた状態で37°Cで30分間インキュベートします。注:デオキシコール酸ナトリウムは、細胞からのAAV放出を促進するために使用されました。 生AAV溶液を2 mLの遠心チューブに分配し、14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を50mLの円錐管に移します。注:1mLピペットを使用して上清を移します。ペレットを捨てます。 同量のクロロホルムを添加し、1〜2分間ボルテックスしてAAVを抽出します。注:溶液は不透明で、白く、ミルクのようになるはずです。 乳液を2mLの遠心チューブに移し、均等に分配します。14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上部のピンクの層を慎重にピペットで取り出し、新しい50mLのコニカルチューブに移します。注:クロロホルム/タンパク質層を乱さないでください。 ピペットを使用して最終容量を測定します。生のAAV-PEG-硫酸塩ボリュームチャート(表2)に従って、50%(NH4)2SO4 と40%PEG溶液の適切な量を混合します。2分間渦巻きます。 混合物を2 mLの遠心分離チューブに移し、均等に分配します。14,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します 22 Gの針と3 mLのシリンジを使用して最下層を回収します。AAVを50 mLのコニカルチューブに集め、4°Cで保存して、後でヨージキサノールグラジエント超遠心分離を行います。 6. ヨージキサノールグラジエント超遠心分離法によるAAV精製 AAVをロードする前に、使用する超遠心チューブの数に応じて、iodixanolグラジエントを新たに調製してください(表3)。注:フェノールレッドは、層を観察するために使用されました。 16 Gのパントロングニードルを取り付けた10 mLシリンジを使用して、各溶液をラウンドトップポリプロピレン超遠心分離機クイックシールチューブにゆっくりと重ねます。泡を避けてください。 22 Gシリンジでグラジエントの上に最大17 mLのAAV溶液を慎重に追加します。AAV透析バッファーを使用してチューブを補充します。注:超遠心チューブの壁に液滴を装填して、AAV溶液を追加します。グラデーションレイヤーを邪魔しないでください。 超遠心チューブを電気シーラーで密封します。注:チューブを超遠心分離機に送る前に、チューブのバランスを±0.2 g差で調整してください。 Ti70ローターで350,000 x g で2時間、4°Cで遠心分離します。 チューブをローターから慎重に取り外し、超遠心チューブラックに入れます。注意: グラデーションが乱されていないことを確認してください。 以下の手順に従ってAAVフラクションを収集します。スタンドホルダーでチューブを安定させます。 10mLシリンジに取り付けた19Gの針で、40%〜60%の界面のわずかに下にある超遠心チューブに穴を開けます。注意: 針の開口部は、40%の勾配に面して上向きにする必要があります。 チューブの上部に16Gの針で穴を開けます。 チューブあたり最大5mLを収集します。25%〜40%の界面でのタンパク質汚染の収集を避けてください。 各超遠心チューブについて繰り返します。注:AAVフラクションを50mLコニカルチューブに移します。 7. 第2ラウンドのiodixanolのグラジエントのultracentrifugationの 注: この手順はオプションです。このステップは、空のAAV比を減らして、より高品質のフルAAVキャプシドを実現することです。 AAVをAAV透析バッファーで>1:1に希釈します。注:最初の超遠心分離ラウンドから収集されたAAVは、40%のヨージキサノール層にありました。30%のヨージキサノール層の上に装填できるように、少なくとも50%希釈する必要があります。 16 Gのパント針を使用して各溶液(表4)を超遠心チューブに重ね、10 mLシリンジをゆっくりと取り付けます。泡を避けてください。 20 mLの希釈AAV溶液をグラジエントの上に22 Gシリンジで慎重に加えます。AAV透析バッファーを使用してチューブを補充します。 手順 6.4 から 6.7 を繰り返します。 8. AAV透析と濃縮 新しい18G針と10mLシリンジを使用して、AAVウイルスを透析カセットに移します。ウイルスをゆっくりとカセットに注入し、カセットから空気を取り除きます。 AAV透析バッファーの入ったビーカーに攪拌子を加え、攪拌板の上に置きます。 透析カセットをフロートブイで透析バッファーに入れます。4°Cで攪拌します。 AAV透析バッファーの2〜3倍に変更します。注意: カセットが浮いてバッファ交換を実行するのに十分なバッファを使用してください。ビーカーをアルミホイルで覆います。 18Gの針を取り付けた10mLのシリンジを使用して、カセットからウイルスを遠心フィルターユニットに集めます。 4,000 x g で4°Cで15〜30分間遠心分離します。注:AAVをAAV透析バッファーで2〜3回すすぎます。AAVを~200μLの残りがフィルターの上部に来るまで濃縮します。 濃縮されたAAVをフィルターユニットから収集します。フィルターをさらに300μLのAAV透析バッファーですすぎ、濃縮AAVに移します。 1 mL のツベルクリン ルアー スリップ シリンジを使用して、0.22 μm シリンジ フィルターでウイルスをろ過します。体積損失を最小限に抑えるには、10 mLシリンジを使用してフィルターに空気を2〜3回押し込みます。 精製したAAVウイルスを4°Cで一時的に保存し、滴定します。注:ウイルスを滴定し、分注し、1週間以内に-80°Cで保存してください。 9. AAVウイルス滴定 注:TaqMan 定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用して、精製された AAV を滴定しました。 AAVベクターをDNase Iで処理し、37°Cで30分間インキュベートした後、95°Cで10分間インキュベートします。注:10 μLの反応例として、2 μL AAVウイルスサンプル、1 μL DNase、1 μL DNaseバッファー、および6 μL H2Oを使用します。PCRチューブを備えたサーモサイクラーで行うことができます。 AAVインサート領域をターゲットとするプライマーセットを調製します。注:ターゲットは、AAVコンストラクトのプロモーター、導入遺伝子、およびレポーターであり得る。プライマーを 表5に示します。 DNAプラスミド標準試料(10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 pg/μL)とネガティブコントロール(H2O)を調製します。 プライマーを含むqPCRマスターミックスを、製造元の指示に従って調製します。 標準試料とサンプルをPCRプレート上に三重に置きます。qPCRミックスを標準試料およびサンプルに加えます。プレートを密封し、製造元の指示に従ってqPCR反応を行います。注:反応条件は、材料/試薬および装置によって異なります。高速で従来のPCRサイクルが適用できます。 AAVウイルス力価を計算します。注:このプロトコルのサンプル濃度は、元のサンプルから1/10希釈されています。 AAVウイルスを1.5mLチューブに分注し、4°Cで最大1ヶ月間保存し、-80°Cで長期保存します。注意: ストレージの凍結/解凍サイクルは避けてください。 in vivo 実験に使用する場合は、2回以上の解凍液を使用しないでください。 10. AAVの品質管理 注:AAVウイルスは、SDS-PAGEゲルを用いたSDS-PAGE銀染色による純度評価と、市販の染色キットを用いた染色を行いました。 Laemmli バッファーで AAV ウイルス サンプルの 3 x 109 vg を変性させます。注:対照として参照AAVウイルスを使用します。AAV6-CMV-GFPリファレンスフルキャプシドが使用されます。 変性させたAAVを4%〜20%のグラジエントSDS-PAGEゲルにロードし、180Vで50分間泳動します。 電気泳動プレートからゲルを取り出します。製造元の指示に従って、銀染色キットでゲルを染色します。 AAVキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を確認します。注:純粋なAAVウイルスには、VP1、VP2、およびVP3キャプシドタンパク質のみが含まれています。純粋でない場合、他のタンパク質バンドがゲル上に見えます。注:ネガティブ染色された組換えAAVビリオンの透過型電子顕微鏡(TEM)は、形態学的完全性およびフル/エンプティ比を評価するために行われた。 ピンセットでEMグリッドを手に取り、グリッドの光沢のある面を上に向けてベンチに置きます。 5 μLのAAVサンプルをグリッドにピペットで移し、蒸発させて乾燥させます。注意: 必要に応じてAAVを希釈します。1012 vg/mL は平均力価です。グリッドを乾燥させるのに30〜60分かかる場合があります。 ピペッティングでグリッドを洗浄し、約200 μLのH2Oをグリッド上に一滴ずつ入れます。 グリッドの隣にクロマトグラフィーペーパーを垂直にゆっくりと置いて、余分な水分を取り除きます。 5 μLの2%酢酸ウラニル溶液をグリッドにピペットで移します。5分間インキュベートし、上記のように吸い取ります。グリッドを乾かします。 透過型電子顕微鏡(50,000倍倍)でAAV粒子を可視化します。ウイルスゲノムを持つウイルスキャプシドは均質な白い六角形として表示され、空のカプシドは白い縁を持つが中心が暗い六角形として表示されます。 少なくとも 100 個の粒子をランダムに数えて、完全な 粒子と完全な粒子のおおよそのパーセンテージを決定します。空の AAV パーティクル。