糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

1. 飽和移動差NMR(STD-NMR) 注:後続の行では、STD-NMR実験を取得、処理、および分析するための基本的な手順を概説しています。これらのステップは、リガンド結合を検出し、リガンド結合エピトープを解明するためのこの技術の有用性を例示する役割を果たします。NMR実験の設計と取得についてより深く理解するには、NMR装置に付属の対応するメーカーのマニュアルを参照してください。 取得タンパク質-リガンド複合体でサンプルを調製します。糖鎖:レクチンのモル比は10:1から100:1で、タンパク質濃度は0.01〜0.2 mMの範囲です。 hGalectin-7とLacNAcとの相互作用には、pH 7.4の重水素化リン酸緩衝生理食塩水中のタンパク質:リガンド比を50:1にしてください。注:タンパク質受容体は、純粋で、選択したバッファーに可溶でなければなりません(STD-NMR実験の場合 、1HNMRシグナル干渉の可能性を減らすために、対応するバッファーの重水素化バージョンが望ましいです)。タンパク質の濃度は、280nmでの吸光度を測定するために、分光光度計を使用して事前にチェックされます。 調製した溶液から、ピペットを使用して総容量0.6 mLを5 mmのNMRチューブに移します。 必要な温度でNMR装置を準備します(一般的な実験温度は10°Cから45°Cの間です)。edteコマンドを使用して温度制御モニターを開き、希望の温度を設定します。hGalectin-7/LacNAc試験では、温度を25°Cに設定しました。 zg パルス シーケンスを含む新しいデータセットを生成します。簡単な操作の場合は、既存の実験を開き、 edc コマンドを入力します。ダイアログボックスが表示され、タイトル、特性(サンプル仕様、溶媒)、および実験の一部のパラメータを定義します。 元のパルスシーケンスからの変更が必要な場合は、ased(パラメータ)ウィンドウとAcquParse(取得パラメータ)ウィンドウをナビゲートします。この時点で、分光器のライブラリから目的のパルスプログラムを選択します。 標準的な1HNMRスペクトルの場合、利用可能なリストからzgパルスシーケンスを選択します。注:水分含有量が増加したサンプルの場合、S/N比を高めるために水抑制スキームの使用が必要になる場合があります。zgesgpのようなパルスシーケンスの使用が望まれます。これは、優れた抑制を提供する励起スカルプティングモジュールでありながら、残りの信号の位相を制御するモジュールです。水抑制スキームの種類とその主な特性の詳細については、メーカーのNMRチュートリアルを参照してください。 サンプルリフトエアを作動させて、NMRサンプルをプローブに挿入します。 ej コマンドを使用し、サンプルを磁石の上部に配置し、 ij コマンドを使用してサンプルのリフトを無効にします。注:オートサンプラーを使用してサンプルを磁石に注入するには、コマンド sx を使用し、その後にオートサンプラートレイ内のNMRチューブの位置に対応する位置番号nを指定します。 コマンドlockを入力し、メニューから適切な溶媒を選択することで、溶媒信号をロックします。 サンプルをプローブに挿入したら、自動モジュールatmaまたは手動モジュールatmmを使用してチューニングとマッチングプロセスを完了します。 topshim gui コマンドで自動シミングを開始します。これにより、グラフィカルインターフェースが開き、シム寸法1Dが選択されて開始されます。注:微妙な磁場や温度変化によるシミングの不安定性を最小限に抑えるために、実験取得のためにオートシムをアクティブにすることができます。これは、BSMS 制御ウィンドウにアクセスし、autoshim をクリックすることで実行できます。緑色のハイライトに変わると、オートシムがアクティブになったことを示します。オートシムを使用する際には、サンプルの不安定性の問題に気づかないように注意してください。したがって、オートシムを使用する場合は注意が必要です。 1H 90° パルスを決定します。これは、pulsecal コマンドによって自動的に実行できます。 AcquPars ウィンドウでさまざまなパラメータを変更します。通常の1HNMRスペクトルの場合、スキャン数(NS)を32に設定し、目的のスペクトルウィンドウ(SW)をcaに設定します。12 ppmです。注:zgesgpパルスシーケンスには、スペクトルの中央に配置するべき残留HDO信号を除去するための溶媒抑制用のモジュールが含まれています。この目的のために、O1はAcquParsで正確に定義する必要があります。 自動コマンド rgaでオーバーフローを避けるために、レシーバーゲインを設定します。 次に、zgコマンドを使用して標準の1HNMRスペクトルを取得します。 取得が完了したら、efp コマンドを使用してスペクトルを処理します。TopSpinメニューバーを使用して、ベースライン補正と位相補正を適用します。注:糖鎖とタンパク質に由来する 1HNMRシグナルが観察されます(図1)。取得したNMRスペクトルの詳細な分析は、セクション1.1.14で概説されているように、STD NMR実験の実施に推奨されます。 新しいデータセットを作成し、セクション1.1.4の 1HNMR実験で説明したのと同じ方法で使用するSTD NMRパルスシーケンスをアップロードします。ブルカーの機器では、パルスプログラムカタログにさまざまなパルスシーケンスがあり、すべて stddiffXXXという名前が付けられています。最も単純なもの (stddiff) には、水抑制スキームやタンパク質抑制フィルターは含まれていません。H2O 含有量が高いサンプルの場合は、ウォーターゲートまたは励起スカルプティングモジュールを含む stddiffgp19 または stddiffesgp 配列のいずれかを選択します。強いタンパク質NMRシグナルをバックグラウンドとするスペクトルの場合は、 stddiffXXX.3 配列を選択します。いずれの場合も、各水抑制モジュールに対応する特定のパラメータ(つまり、ウォーターゲートスキームのd19)を最適化します。 STD NMR実験のオフ共振周波数とオン共振周波数を定義します。周波数リストは、FQ2LISTエントリの下のasedウィンドウのAcquParsパラメータで見つけます。定義されたオン共振周波数とオフ共振周波数をヘルツで手動でリストに書き込み、新しい名前で保存する必要があります。この新しいリストは、STD-NMR実験で使用されます。一般的な糖鎖では、糖鎖シグナルのないスペクトル領域(通常は約δ(1H) 0または6.6 ppm)でのオン共鳴周波数を選択します(図1)。オフ共鳴周波数は、リガンドやタンパク質のプロトンを示さない領域に設定します。+18000Hzまたは-18000Hzに安全に設定できます。 飽和時間中に使用される整形パルスを、ased ウィンドウの AcquPars パラメーターで定義します。注:多くの可能性があります。ガウス形状またはエバープ形状は、選択パルスの幅が90°で50msと安全に使用できます。 AcquPars セクションで対応するパラメーターを設定します。パルス長を 1H 90° に設定します。 整形パルスの電力値を設定します (整形ツールで推定)。 合計飽和時間を設定します。1 秒から 4 秒の間の値を定期的に使用できます。 緩和遅延を 3 秒に設定します。 スキャン数 (NS) を 8 の倍数に設定します。通常、256、512、または1024に設定して、各周波数で2つのセットで適切な信号対雑音比を取得します。 ダミースキャン(DS)の数を8に設定します。 F2 のポイント数を 16k、32k、または 64k に設定します。注意: F2のポイント数を増やすと、解像度と信号対雑音比が向上します。そのため、最低16kのデータポイントを使用することを強くお勧めします。 F1 でポイント数を設定します。これは使用される周波数の数で、この場合は2(オンレゾナンスとオフレゾナンス)です。注:慣例により、F2は直接次元、つまり自由誘導崩壊(FID)が直接サンプリングされる次元を指し、F1は間接次元を示します。 自動コマンド rgaでのオーバーフローを避けるために、レシーバーゲイン(RG)を設定します。 exptコマンドを使用して、実験全体の時間を計算します。 zg コマンドを使用して、取得用の実験を送信します。 数分後にテストが正常に実行されていることを常に確認してください。 加工注:擬似2Dスペクトルは、上記のプロトコルを適用した後に取得されます。行の数は、使用される周波数の数に対応し、通常はオンレゾナンスとオフレゾナンスの2つになります。最初の実験の fid を処理します。fid 番号 1 のフーリエ変換を行い ( efp コマンドを使用)、処理されたスペクトルの目的地を選択します (procno 番号を選択)。あるいは、 rser 1 コマンドを使用して、最初の fid を読み取ります。 次に、lbコマンド(通常は3〜5 Hz)を使用して線幅拡大係数と位相を調整します。手動でフェーズを設定するには、[プロセス]タブをクリックし、フェーズのサブメニューを調整します。ゼロ補正と一次補正を実行するには、対応するボタンをクリックしてドラッグします。フェーズ結果を保存します。さらに、コマンド abs を使用してベースライン補正を実行します。 2 番目の実験の fid を読み取り、同じ線幅拡大係数でフーリエ変換を ( efp コマンドで) 行います。同じ位相パラメータとベースライン補正で位相を調整し、処理されたスペクトルを別のコードで保存します。 多重関数(コマンド: .md)で処理された2つのスペクトルを読み取り、多重可視化(Δ)で使用可能なボタンを使用してそれらを減算します(オフ共鳴-オンレゾナンス)。新しいスペクトルはSTD NMRスペクトルであり、異なるコードで保存されます。 STD NMRスペクトルとオフレゾナンススペクトルを重ね合わせます。オフレゾナンススペクトル(fid 1)を開き、 .md コマンドを入力してマルチプルディスプレイウィンドウを開きます。次に、STDスペクトルをアップロードします。 STD NMRスペクトルの信号の周波数と強度(右上に自動表示)を比較します。これにより、タンパク質に近いプロトンとその相対的な近接性に関する必要な情報が得られます。相対強度が高いほど、タンパク質に近くなります(図2)。 対応するソフトウェアを使用して、オフ共振実験の強度(積分)を測定します。TopSpin で、[ 解析] > [統合] に移動します。領域を定義し、積分をファイル(I0)に書き込みます。 STD NMR実験で強度(積分)を同じパラメータで測定し、ファイル(ISTD)に書き込みます。 次の式を使用して、各陽子信号の STD 値を計算します。STD = (ISTD)/I0 です。注:注:STD値の計算に信号積分を使用するには、プロトン信号を十分に分離する必要があります。オリゴ糖のようにシグナルのオーバーラップが発生した場合、STDとオフレゾナンススペクトルのシグナル強度比を評価することでSTD値を求めることができます。 相対的なSTDをパーセンテージで計算します。これを行うには、オフ共鳴とSTD NMRスペクトルの強度との間に最大の差を示す陽子に100%の値を与えます。それに応じて、他の陽子の相対的なSTD強度を計算します。注:STDデータの適切な解析、特にリガンド結合エピトープの決定には、リガンドの 1Hシグナルの完全な割り当てが必要です。したがって、このタスクはSTDスペクトルを取得する前に完了することを強くお勧めします。 2. H-15N HSQC実験1件 注:以下の行は、リガンド(オリゴ糖)19の増加量の存在に応答して、受容体(レクチン)の1Hおよび15NNMR共鳴の化学シフトの変化を監視するための1 H-15N HSQC実験の採用を詳述している。抽出されたデータに基づく化学シフト摂動(CSP)解析は、結合パートナーの同定だけでなく、タンパク質結合界面のマッピングや結合親和性の決定にも非常に価値があります。NMR実験の設計と取得についてより深く理解するには、NMR装置に付属の対応するメーカーのマニュアルを参照してください。 取得と処理目的のレクチンを含むサンプルを調製します。受容体が、骨格鎖と側鎖の両方で、すべてのアミノ酸残基に 15N標識されていることを確認してください。通常、スペクトル内の水交換可能なHNクロスピークを検出するには、H2O:D2Oの90:10混合物を使用して緩衝溶液を調製します。必要なレクチン濃度は、 15N標識受容体の利用可能性と必要なS/N比に応じて、0.05〜0.2 mMの範囲です。注:タンパク質は、NMRチューブ内で目に見える沈殿物の生成なしに、実験時間全体にわたって安定している必要があります。さらに、それは純粋で、選択されたバッファーに可溶でなければなりません。HSQCクロスピークの 1Hおよび 15Nの完全な割り当ては、HSQCスペクトルのすべてのクロスピークが特定のアミノ酸残基に対応する標識で識別されるように、事前に実施しておくべきでした。 この調製物から、総量0.6mLを5 mm NMRチューブに移します。 NMR装置を必要な温度に設定します。ステップ 1.1.3 を参照し、同じ操作に従います。 新しいデータセットを作成します。ステップ 1.1.4 を参照し、操作を繰り返します。 ステップ1.1.5の説明に従って、NMRサンプルをプローブに挿入します。 溶媒シグナルをロックします。ロック手順を開始するには、コマンドロックを使用し、メニューから適切な溶媒を選択します。ロック信号は、ロックウィンドウでトレースできます。ロック信号がロックウィンドウに表示されるように、ロックゲインを設定します。 チューニングとマッチングのプロセスを自動的に(atmaコマンドを使用)または手動で(atmmコマンドでATM制御ウィンドウを開き、ウォブルカーブを調整します)完了します。 TopShim ツールを使用して、最適なシムを設定します。 コマンド topshim gui を使用します。ステップ 1.1.8 の手順を参照してください。 1H 90°のパルス長(ステップ1.1.9で説明)とオフセット周波数(コマンドo1calibはインタラクティブなO1キャリブレーションルーチンを実行し、オフセット周波数を取得します)を決定します。この後者のパラメータは、溶媒抑制スキームを用いた実験を採用する場合に非常に重要です。 セクション 1.1.4 の説明に従って、新しいデータセットを作成します。H2O 信号の干渉を低減または排除するには、パルス シーケンス zgesgp を使用します。 AcquPars ウィンドウでさまざまなパラメーターを変更して、実験を設定します。以前に決定したように 、1H 90°のパルス長とオフセット(o1)を導入し、スキャン数(NS)を32に、スペクトルウィンドウ(SW)を約12ppmに設定します。 TopspinメニューバーにあるShapeツールを使用して、整形パルスのパワーレベルを決定します。 自動コマンド rgaでレシーバーゲインを設定します。 zgコマンドを使用して実験を取得し、得られたFIDを処理して1H NMRスペクトルを取得します。 1 H-15N HSQC NMR 実験の獲得に使用する新しいデータセットを作成します。[AcquParse] タブで、パルス プログラム カタログで使用可能なパルス プログラム hsqcetfpf3gp を選択します。 テストを設定します。デフォルトの形状、累乗、および時間を、 コマンド getprosol を使用して読み込みます。次に、 1H 90° のパルス長とオフセットの値を更新します。 次のパラメータを定義します。緩和遅延を1〜5秒に設定します。 スキャンの数を 4 の倍数に設定します。通常、適切な信号対雑音比を得るために、8、16、32、または64に設定されます。 ダミースキャンの数を 128 に設定します。 F2 のポイント数を 1k、2k、または 4k に設定します。 F1の点数を設定します:使用するt1 の増分の数。スペクトルウィンドウに応じて、これは128から256の間です。 15N 次元のスペクトル ウィンドウの中心を 117 ppm δに調整し、対応するスペクトル幅を 36 ppm に設定します。これらの値は、特定のシステムごとに最適化する必要があります。 オーバーフローを避けるためにレシーバー・ゲインを設定します ( rga コマンドを使用) 合計実験の時間を計算します。一般的な実験時間は約1時間です。 「zg」と入力して、実験を集録用に送信します。注:数分後に実験が正しく実行されていることを常に確認してください。 コマンド xfb を使用して FID を処理します。コマンド abs2 を使用してベースライン補正を実行し、[プロセス] タブの phase corrections を実行します。手動で位相を調整するには、位相調整サブメニューをクリックし、2Dスペクトルのいくつかのクロスピークを選択します。その後、対応するボタンをクリックしてドラッグし、行と列の両方にゼロ補正と一次補正を順番に適用します。フェーズ結果を保存します。 結果の 2D スペクトルを保存します。 リガンドの高濃度ストック溶液を調製します。一般的な値は 50 〜 100 mM です。 糖鎖の高濃度ストック溶液から、対応する容量(数マイクロリットル)を受容体を含むNMRチューブに移し、目的のタンパク質:リガンドモル比を得て、スペクトルを記録します。注:このステップでは、リガンドがタンパク質サンプルに滴定される滴定シリーズが開始されます。適切なタンパク質対リガンド比は、特定のケースごとに決定する必要があります。結合親和性が完全に不明な場合は、初期点にリガンドのサブ化学量論的量を使用することをお勧めします。 新しく準備したサンプルに対して、手順 2.1.1 から 2.1.19 を実行します。 タンパク質とリガンドの比率が増加しているサンプルについて、ステップ2.1.21と2.1.22を繰り返します。注:滴定シリーズデータを正確にフィッティングするには、タンパク質飽和を達成するために必要なものを含む、幅広いタンパク質対リガンド比をカバーする複数の 1 H-15N-HSQC実験を取得する必要があります。 解析適切なソフトウェアを使用して、アポ種の処理された2D HSQCスペクトルを可視化します:TopSpin、MestReNova、およびCCPNMRはすべて、NMRデータを処理するのに適したプログラムです。注:これはタンパク質のフィンガープリントスペクトルです。観察された 1Hおよび 15Nの化学シフトは、各アミノ酸の対応する化学環境に依存し、これはタンパク質の3D構造に強く依存します。このスペクトルは、タンパク質フィンガープリントスペクトルと呼ばれます。すべてのクロスピークが均一な強度を示す、十分に分散した2D 1 H-15N HSQCスペクトルは、よく折りたたまれたタンパク質の存在を強く示唆している19。 すべてのクロスピークについて 、1H と 15N の周波数のリストを生成します。CCPNMRプログラム20のような補助ソフトウェアの使用は、このプロセスを支援することができる。 1番目または2番目の滴定ポイントのスペクトルをアポタンパク質のスペクトルに重ね合わせます。これを行うには、アポ状態に対応する2Dスペクトルを開き、[マルチプルディスプレイ]タブをクリックしてから、2番目の2Dスペクトルを追加します。両方のスペクトルを目視検査することで、リガンドとタンパク質との間の相互作用の存在に関する情報が得られます。注:タンパク質の観点からは、結合の存在は、認識イベントに直接関与するアミノ酸の化学環境に変化をもたらし、それに伴う化学シフト摂動(CSP)をもたらします。 滴定ポイントごとにステップ 2.2.2 と 2.2.3 を繰り返し、異なるタンパク質-リガンドモル比に対応する、異なるスペクトルのすべてのクロスピークの 1H および 15N 周波数のリストを生成します。注:各滴定ポイントでの化学シフトは、新しいクロスピーク割り当てを実行することなく測定できます。レクチンと糖鎖の相互作用でよく見られる高速交換レジームの場合、滴定全体を通してピークの漸進的な動きを単純に追跡することができます。 最後の滴定ポイントについて、前の添加に対して基本的に化学シフト摂動がないことを確認します。この事実は、タンパク質結合部位がリガンドで飽和しており、リガンドが過剰に過剰であることを示しています。 以下の式を使用して、最大化学シフト摂動 (maxCSP) を計算します。ΔHとΔδN は、それぞれアポ状態と最後の滴定点との間の 1Hおよび 15N周波数の化学シフト差です。 2D プロットの垂直方向の y 軸の最大化学シフト摂動 (maxCSP) と、対応するアミノ酸残基 (水平方向の x 軸) をプロットします。 タンパク質の結合状態とアポ状態の間の最大のCSPを示すアミノ酸残基を目視検査します。それらは結合部位に属しているか、または結合部位に隣接している可能性が高いです。 タンパク質の 3D 構造が利用可能な場合は、PyMOL や BIOVIA Discovery studio などの適切なソフトウェアで対応する PDB を開きます。これらの分子可視化プログラムは、構造生物学のアプリケーションで広く使用されています。推定結合部位を局在化するために、特定の色で最も高いmaxCSP(標準偏差の2倍以上)を示す残基を選択します。 高速交換レジームの場合、各ポイントでの 1 H-15N HSQC クロスピーク (Δδobs) に対する観測された CSP の非線形最小二乗近似から、そのポイントでの特定のタンパク質 [P] およびリガンド [L] 濃度に対して解離定数 (KD) を推定します。注:この式は、明確な分離信号を示すクロスピークに適用できます。得られた値は、KDの推定値を提供するために平均化されます。