Démêler les interactions glycanes-protéines : la résonance magnétique nucléaire (RMN) à la rescousse
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillant l’acquisition, le traitement et l’analyse d’une série d’expériences RMN visant à caractériser les interactions protéine-glycane en solution. Les méthodologies les plus courantes basées sur les ligands et les protéines sont décrites, qui contribuent sans aucun doute aux domaines de la glycobiologie structurale et des études de reconnaissance moléculaire.
Abstract
Les interactions des glycanes avec les protéines modulent de nombreux événements liés à la santé et à la maladie. En fait, l’établissement de ces événements de reconnaissance et leurs conséquences biologiques sont intimement liés aux structures tridimensionnelles des deux partenaires, ainsi qu’à leurs caractéristiques dynamiques et à leur présentation sur les compartiments cellulaires correspondants. Les techniques de RMN sont uniques pour démêler ces caractéristiques et, en effet, diverses méthodologies basées sur la RMN ont été développées et appliquées pour surveiller les événements de liaison des glycanes avec leurs récepteurs associés. Ce protocole décrit les procédures d’acquisition, de traitement et d’analyse de deux des méthodologies de RMN les plus puissantes employées dans le domaine de la glycobiologie RMN, la différence de transfert de saturation 1H (STD) et lesexpériences de titrage de cohérence quantique unique (HSQC) 1 H,15 N-hétéronucléaire, qui offrent des informations complémentaires du point de vue des glycanes et des protéines, respectivement. En effet, lorsqu’ils sont combinés, ils offrent une boîte à outils puissante pour élucider à la fois les aspects structurels et dynamiques des processus de reconnaissance moléculaire. Cette approche globale améliore notre compréhension des interactions glycanes-protéines et contribue à faire progresser la recherche dans le domaine de la glycobiologie chimique.
Introduction
La reconnaissance moléculaire des glycanes est essentielle pour de nombreux processus liés à la santé et à la maladie. La spécificité et la sélectivité des récepteurs biologiques (lectines, anticorps, enzymes) pour les glycanes dépendent fortement de l’ajustement de l’équilibre précaire entre les divers composants de l’enthalpie (CH-π et van der Waals, liaisons hydrogène, électrostatique) et de l’entropie (hydrophobie, dynamique, solvatation-désolvatation)1.
Compte tenu de la grande diversité chimique et de la nature dynamique des glycanes, les méthodes RMN ont été largement utilisées pour disséquer les interactions des glycanes depuis plus de 25 ans2, car ces méthodologies fournissent d’excellentes informations sur les événements de reconnaissance moléculaire avec des détails précis, à une résolution atomiquede 3,4, même lorsque les preuves d’interaction requises ne peuvent pas être récupérées en utilisant d’autres méthodologies. En tant que point clé, la RMN est polyvalente et permet d’étudier des événements dynamiques, au niveau atomique, à différentes échelles de temps, constituant de loin la meilleure technique pour étudier la structure, la conformation et la dynamique des glycanes en solution. Néanmoins, démêler ces informations peut être un processus assez complexe qui nécessite l’utilisation de stratégies bien définies ainsi qu’une analyse minutieuse des données5.
Les techniques de RMN sont diverses et, en effet, il existe de nombreuses méthodologies qui peuvent être utilisées pour démêler les interactions glycanes-protéines6. Nous décrivons ici deux approches de base de RMN qui sont actuellement employées pour déchiffrer les interactions glycanes-récepteurs 7,8, en mettant l’accent sur la façon de démêler la présentation de l’épitope clé du glycane ainsi que du site de liaison aux protéines9.
Dans tout événement de reconnaissance moléculaire, lorsqu’un récepteur se lie à un ligand donné, il y a un processus d’échange chimique qui affecte de nombreux paramètres RMN des participants à la liaison10. Par conséquent, du point de vue de la RMN, l’interaction peut être suivie soit du point de vue du ligand du glycane, soit du point de vue du récepteur protéique11. D’une manière générale, le récepteur protéique est une grande biomolécule (mouvement de rotation lent, avec des vitesses dans l’échelle de temps ns, et donc, une relaxation transversale rapide), tandis que le glycane en interaction peut être considéré comme une molécule de taille petite à moyenne (mouvement de rotation rapide, avec des vitesses dans l’échelle de temps ps, et relaxation transversale lente)12. D’un point de vue standard, les signaux RMN du glycane sont étroits, tandis que ceux du récepteur sont larges13.
Les méthodes RMN basées sur les ligands reposent sur le changement spectaculaire que subissent de nombreux paramètres RMN des glycanes lors du passage de l’état libre à l’état lié14. La RMN-STD est la technique de RMN expérimentale la plus utilisée pour évaluer diverses caractéristiques de liaison des glycanes15, de la déduction de l’existence de la liaison à l’état de solution à la détermination de l’épitope de liaison des glycanes ; c’est-à-dire les atomes du ligand qui sont en contact avec le récepteur protéique16.
Alternativement, les méthodes RMN basées sur les récepteurs surveillent les changements qui se produisent dans les signaux du récepteur protéique en présence du glycane par rapport à ceux enregistrés pour l’état apo17. Ceux-ci sont principalement axés sur le criblage des perturbations chimiques des signaux protéiques entre les deux états. L’expérience la plus couramment utilisée est le HSQC 1 H-15N, ou ses alternatives TROSY18.
La combinaison des deux approches permet d’appliquer la RMN à de nombreux systèmes divers qui présentent un large éventail d’affinités. Cependant, pour les méthodes RMN basées sur les récepteurs, contrairement à celles basées sur le ligand, une quantité relativement importante de protéines solubles, non agrégées et marquées à des isotopes stables (15N) doit être disponible.
Nous décrivons ici les deux méthodes, en soulignant leurs forces et leurs faiblesses. Notez que les étapes de base décrites dans le protocole servent d’exemples pour l’utilisation des spectromètres Bruker. Par conséquent, les noms des commandes et des paramètres s’alignent sur ceux utilisés dans TopSpin (le logiciel de contrôle des spectromètres de Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
La RMN par différence de transfert de saturation (STD-NMR) est devenue la méthode RMN la plus utilisée et la plus polyvalente pour étudier les interactions ligand-protéine. Comme montré ci-dessus, il repose sur le phénomène de transfert de saturation, et le dispositif expérimental implique l’acquisition de deux spectres unidimensionnels (1D) 1H : le spectre on-resonance et le spectre off-resonance. Au cours de l’expérience sur résonance, la saturation de protons spécifiques de la protéine est obtenue en appliquant un train d’impulsions radiofréquences de faible puissance pendant une certaine période (le temps de saturation varie généralement de 1 à 3 s). Pour éviter la saturation directe du ligand, la fréquence et la longueur des impulsions de saturation sont optimisées pour irradier sélectivement des protons spécifiques de la protéine ; c’est-à-dire qu’ils doivent être appliqués à une fréquence dépourvue de tout signal ligand et avec une longueur appropriée (Figure 1). En règle générale, pour les impulsions de saturation de 50 ms, une différence de 1 ppm doit être maintenue entre la région de saturation et les signaux ligands les plus proches. Généralement, des impulsions de saturation sélectives appliquées sur la région aliphatique de la protéine fournissent des effets de saturation accrus. Alternativement, les protons aromatiques (6-7 ppm) peuvent également être irradiés si la molécule de ligand ne contient aucun signal aromatique. Ceci est très utile pour les glycanes naturels, car ils ne portent pas de groupes aromatiques. Une fois qu’une certaine région de la protéine est irradiée sélectivement, la saturation se propage le long de la protéine via une relaxation croisée dipolaire 1 H-1H (diffusion de spin). Finalement, la saturation atteint les protons protéiques au site de liaison, qui sont ensuite transférés aux protons de sucre qui sont en contact étroit (r < 5 Å) avec le récepteur via les NOE intermoléculaires 1 H-1H. De toute évidence, l’intensité des signaux des protons du ligand saturé diminue. Après avoir reçu la saturation, en raison de la cinétique de liaison, les ligands liés transitoirement (un échange rapide est nécessaire) se dissocient et l’information de saturation s’accumule à l’état libre. En raison de ce processus, les spectres RMN en résonance présentent des signaux diminués (Figure 2).
Pour mettre clairement en évidence cette perturbation d’intensité des noyaux 1H d’un glycane de liaison, un spectre RMN de proton de contrôle (off-resonance) est acquis dans lequel la saturation est appliquée loin de tout récepteur ou signal glucidique (généralement entre 40 et 100 ppm), dans les mêmes conditions. Le spectre 1D soustrait entre la résonance off et la résonance on montre exclusivement les signaux des noyaux 1H du ligand qui ont des intensités modifiées : ceux qui étaient suffisamment proches du site de liaison du récepteur pour recevoir l’aimantation (Figure 2).
Néanmoins, tous les noyaux 1H du glucide lié ne reçoivent pas la même quantité de saturation. Théoriquement, le transfert d’aimantation du récepteur au ligand lié dépend de la distance (1/r6). Cela signifie que les intensités de saturation transférée entre les noyaux de glycane 1H contiennent des informations sur les proximités spatiales entre les protons du ligand et ceux du récepteur, et que les intensités RMN STD sont plus grandes pour les protons qui sont plus proches du récepteur. En conséquence, l’expérience RMN STD permet également de déterminer l’épitope de liaison du glucide (Figure 2 et Figure 3) puisque les protons du ligand situés plus près de la surface de la protéine présentent des intensités plus élevées que ceux qui ne participent pas directement à la liaison.
L’expérience peut être appliquée à des systèmes d’affinité faible-moyenne, rarement à des systèmes à fortes affinités dans la gamme des μM ou nM. En effet, il faut que le taux de dissociation soit rapide dans l’échelle du temps de relaxation. Sinon, l’information de transfert de saturation est perdue par relaxation avant que le ligand ne se dissocie.
D’autre part, les expériences de RMN basées sur les protéines sont uniques pour démêler l’interaction ligand-protéine avec une précision au niveau des acides aminés sans résoudre les structures de résolution atomique. Il examine directement les phénomènes de reconnaissance moléculaire en solution sans avoir besoin de co-cristallisation. La cartographie d’analyse CSP est exceptionnellement puissante pour découvrir des ligands et cartographier le site de liaison aux protéines (Figure 4 et Figure 5). Cette méthode est applicable à toute gamme d’affinités entre les gammes mM et nM, même pour les systèmes où le taux de change est lent sur l’échelle de temps de décalage chimique21.
Néanmoins, cette approche ne fonctionnera probablement pas pour les protéines dont le poids moléculaire est supérieur à 30-40 kDa en raison de problèmes de relaxation. L’alternative TROSY18 peut alors être utilisée, étant particulièrement puissante lorsqu’elle est couplée à la deutération des protéines. De plus, la protéine doit être uniformément marquée avec 15N (et un autre échantillon marqué deux fois avec 13C et 15N pour pouvoir compléter l’affectation de base requise). Par conséquent, les conditions d’expression des protéines, y compris le système d’expression correspondant, doivent être optimisées pour pouvoir obtenir des quantités de milligrammes de protéines. Les protéines qui présentent une tendance à l’oligomérisation ou à l’agrégation ne conviennent pas non plus à cette analyse. L’instrument utilisé ici pour enregistrer les données RMN est un spectromètre Bruker 800 MHz équipé d’une cryosonde TCI. Il serait très difficile d’utiliser cette méthodologie avec des instruments inférieurs à 600 MHz ou sans sonde cryogénique.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Agencia Estatal de Investigación d’Espagne pour l’accréditation du Centre d’excellence Severo Ochoa CEX2021-001136-S, financée par MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, et CIBERES, une initiative de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Espagne). Nous remercions également la Commission européenne pour le projet GLYCOTWINNING.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
Referenzen
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