AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן
Summary
ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ”א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.
Abstract
AQRNA-seq מספק קשר ליניארי ישיר בין ריצוף ספירות קריאה לבין מספרי העתקי RNA קטנים בדגימה ביולוגית, ובכך מאפשר כימות מדויק של מאגר הרנ”א הקטן. הליך הכנת ספריית AQRNA-seq המתואר כאן כולל שימוש במקשרי ריצוף שתוכננו בהתאמה אישית וצעד להפחתת שינויי RNA מתילציה החוסמים את תהליך השעתוק ההפוך, מה שמביא לתפוקה מוגברת של cDNA באורך מלא. בנוסף, מוצג יישום מפורט של צנרת הביואינפורמטיקה הנלווית. הדגמה זו של AQRNA-seq נערכה באמצעות ניתוח כמותי של 45 tRNAs ב- Mycobacterium bovis BCG שנקטפו ב -5 ימים נבחרים במהלך זמן של 20 יום של מחסור בחומרים מזינים ו -6 ימי החייאה. מאמצים מתמשכים לשיפור היעילות והקפדנות של AQRNA-seq יידונו גם כאן. זה כולל בחינת שיטות למייתר טיהור ג’ל להקלה על בעיות דימר פריימר לאחר הגברת PCR ולהגדיל את שיעור הקריאות באורך מלא כדי לאפשר מיפוי קריאה מדויק יותר. שיפורים עתידיים ב-AQRNA-seq יתמקדו בהקלה על אוטומציה ויישום בתפוקה גבוהה של טכנולוגיה זו לכימות כל מיני הרנ”א הקטנים בדגימות תאים ורקמות מאורגניזמים מגוונים.
Introduction
ריצוף הדור הבא (באנגלית: Next generation sequencing או בקיצור NGS) היא טכנולוגיית ריצוף DNA הכוללת פיצול DNA, קשירת אוליגונוקלאוטידים מתאמים, הגברה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף הדנ”א והרכבה מחדש של רצפי המקטעים לגנום. ההתאמה של NGS לרצף RNA (RNA-seq) היא גישה רבת עוצמה לזיהוי וכימות תעתיקי RNA וגרסאותיהם1. התפתחויות חדשניות בתהליכי עבודה של הכנת ספריות RNA וצינורות ניתוח ביואינפורמטיקה, יחד עם התקדמות במכשור מעבדתי, הרחיבו את הרפרטואר של יישומי RNA-seq, והתקדמו מעבר לריצוף אקסומי לאומיקה פונקציונלית מתקדמת כמו פרופיל RNA לא מקודד2, אנליזה של תא בודד3, תעתיק מרחבי 4,5, ניתוח שחבור חלופי6בין היתר., שיטות RNA-seq מתקדמות אלה חושפות תפקודי RNA מורכבים באמצעות ניתוח כמותי של השעתוק בתאים ורקמות נורמליים וחולים.
למרות התקדמות זו ב- RNA-seq, מספר תכונות טכניות מרכזיות מגבילות את הכוח הכמותי של השיטה. בעוד שרוב שיטות ה-RNA-seq מאפשרות כימות מדויק ומדויק של שינויים ברמות ה-RNAs בין משתני ניסוי (כלומר, דגימות ביולוגיות ו/או מצבים פיזיולוגיים), הן אינן יכולות לספק השוואה כמותית של רמות מולקולות ה-RNA בתוך דגימה. לדוגמה, רוב שיטות ה-RNA-seq אינן יכולות לכמת במדויק את המספר היחסי של עותקים של מולקולות איזו-מקובלות tRNA בודדות במאגר תאי של tRNA מבוטא. כפי שמודגש בפרסום הנלווה7, מגבלה זו ל-RNA-seq נובעת ממספר תכונות של מבנה הרנ”א והביוכימיה של הכנת ספריות. לדוגמה, פעילותם של אנזימי הקשירה המשמשים לחיבור מקשרי הריצוף מקצה 3′ ו-5′ למולקולות RNA מושפעת מאוד מזהות הנוקלאוטידים הסופיים של הרנ”א ומקשרי הריצוף. זה מוביל לשינויים גדולים ביעילות של קשירת המקשרים ולעלייה מלאכותית עמוקה ברצף קריאות 8,9,10.
קבוצה שנייה של מגבלות נובעת מהתכונות המבניות הטבועות במולקולות RNA. באופן ספציפי, היווצרות מבנה משני של RNA ושינויים דינמיים בעשרות שינויי RNA שלאחר שעתוק של האפיטרנסקריפטום יכולים לגרום לנפילה או מוטציה של פולימראז במהלך שעתוק הפוך. שגיאות אלה גורמות לסינתזה חלקית או קטועה של cDNA או לשינוי ברצף הרנ”א. בעוד שניתן לנצל את שתי התופעות הללו כדי למפות מבנים משניים או שינויים מסוימים, הן פוגעות בדיוק הכמותי של RNA-seq אם שלבי הכנת הספרייה הבאים נכשלים בלכידת cDNA קטוע או אם עיבוד נתונים זורק רצפים מוטנטים שאינם תואמים למערך נתוני ייחוס11,12. יתר על כן, המגוון הכימי, האורך והמבני העצום של תעתיקי רנ”א, כמו גם היעדר כלים לשבר אחיד של רנ”א ארוך, מקטין את התחולה של רוב שיטות הרנ”א-seq על כל מיני הרנ”א13.
שיטת AQRNA-seq (ריצוף RNA לכימות מוחלט) פותחה כדי להסיר כמה מהאילוצים הטכניים והביולוגיים הללו המגבילים את הדיוק הכמותי7. על ידי מזעור הטיות תלויות רצף בלכידה, קשירה והגברה במהלך הכנת ספריית ריצוף RNA, AQRNA-seq משיג ליניאריות מעולה בהשוואה לשיטות אחרות, ומכמת במדויק 75% מספריית הייחוס של 963 miRNA בדיוק של פי 2. מתאם ליניארי זה של ריצוף, ספירת קריאה ושפע RNA נצפה גם בניתוח של מאגר אורך משתנה של תקני RNA אוליגונוקלאוטידים ובהתייחסות לשיטות אורתוגונליות כמו כתם צפוני. קביעת ליניאריות בין ריצוף ספירת הקריאה לבין שפע הרנ”א מאפשרת ל-AQRNA-seq להשיג כימות מדויק ומוחלט של כל מיני הרנ”א בדגימה.
להלן תיאור של הפרוטוקול עבור זרימת עבודה להכנת ספריית AQRNA-seq וצינור ניתוח הנתונים הנלווה במורד הזרם. השיטה יושמה כדי להבהיר את הדינמיקה של שפע tRNA במהלך תרדמה הנגרמת על ידי רעב ולאחר מכן החייאה במודל Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) של שחפת. הוצגו תוצאות להדמיה גישושית של נתוני הריצוף, יחד עם אשכולות וניתוחי ביטוי דיפרנציאליים שחשפו דפוסים ניתנים להבחנה בשפע tRNA הקשורים לפנוטיפים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תהליך העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq נועד למקסם את לכידת הרנ”א בתוך דגימה ולמזער את נפילת הפולימראז במהלך שעתוק לאחור7. באמצעות קשירת מקשר דו-שלבית, אוליגוס DNA חדש (Linker 1 ו-Linker 2) נקשר בעודף כדי להשלים באופן מלא את ה-RNA שבתוך הדגימה. ניתן להסיר ביעילות קישורים עודפים באמצעות RecJf, אקסונוק…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברי העבודה הנוכחית אסירי תודה למחברי המאמר המקורי המתאר את טכנולוגיית AQRNA-seq7. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) וקרן המחקר הלאומית של סינגפור באמצעות הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה עמידות מיקרוביאלית IRG.
Materials
| 2-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | 75890 | Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2938C | |
| 5'-deadenylase (50 U/μL) | New England Biolabs | M0331S (component #: M0331SVIAL) | Store at -20 °C |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | M0437M (component #: N0437AVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
| AGAROSE GPG/LE | AmericanBio | AB00972-00500 | Store at ambient temperature |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F2262 | Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C |
| Bioanalyzer Small RNA Analysis | Agilent | 5067-1548 | The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation) |
| Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) | New England Biolabs | B9000 | This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200). |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4441-10 | |
| Demethylase | ArrayStar | AS-FS-004 | Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004) |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L (component #: N0447LVIAL) | This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each) |
| Digital Dual Heat Block | VWR Scientific Products | 13259-052 | Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
| DyeEx 2.0 Spin Kit | Qiagen | 63204 | Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length) |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad Labrotories | PowerPac 300 | |
| Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 0030124537 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 022363611 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 022363204 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL) | Eppendorf | 022363352 | |
| Ethyl alcohol (Ethanol), Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research |
| Gel Imaging System | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS | New England Biolabs | N0556S (component #: B7025SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
| GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840-309000 | The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Scientific Products | BDH3028 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
| Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure | Macron Fine Chemicals | 3032-16 | Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L (component #: B7002SVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| Oligo Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4061 | Store at ambient temperature |
| PEG 8000 (50% solution) | New England Biolabs | M0437M (component #: B1004SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
| Peltier Thermal Cycler | MJ Research | PTC-200 | |
| Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 | Thermo Fisher Scientific | J62336 | |
| PrimeScript Buffer (5X) | TaKaRa | 2680A | |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | TaKaRa | 2680A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | This kit requires a heating block and isopropanol to work with |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0551S (component #: N0551SVIAL) | |
| Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0556S (component #: N0556SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
| RecJf (30 U/μL) | New England Biolabs | M0264L (component #: M0264LVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
| RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) | New England Biolabs | M0314L (component #: M0314LVIAL) | Store at -20 °C |
| SeqAMP DNA Polymerase | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| SeqAMP PCR Buffer (2X) | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | New England Biolabs | M0371L (component #: M0371LVIAL) | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
| T4 DNA Ligase (400 U/μL) | New England Biolabs | M0202L (component #: M0202LVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0202L (component #: B0202SVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) | New England Biolabs | M0437M (component #: M0437MVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
| T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0437M (component #: B0216SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
Referenzen
- Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
- Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.". J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
- Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
- Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
- Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209 (2017).
- Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
- Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049 (2015).
- Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170 (2014).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
- García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939 (2022).
- . FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2022).
- Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
- Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).
