AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

Le séquençage de nouvelle génération (NGS), également connu sous le nom de séquençage massivement parallèle, est une technologie de séquençage de l’ADN qui implique la fragmentation de l’ADN, la ligature d’oligonucléotides adaptateurs, l’amplification basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l’ADN et le réassemblage des séquences de fragments dans un génome. L’adaptation du NGS à l’ARN séquencé (RNA-seq) est une approche puissante pour identifier et quantifier les transcrits d’ARN et leurs variants¹. Des développements innovants dans les flux de travail de préparation de banques d’ARN et les pipelines d’analyse bioinformatique, associés aux progrès de l’instrumentation de laboratoire, ont élargi le répertoire des applications de séquençage de l’ARN, progressant au-delà du séquençage de l’exome vers des omiques fonctionnelles avancées telles que le profilage d’ARN non codant², l’analyse de cellule unique³, la transcriptomique spatiale ^4,5, l’analyse d’épissage alternatif⁶, entre autres. Ces méthodes avancées de séquençage de l’ARN révèlent des fonctions complexes de l’ARN grâce à l’analyse quantitative du transcriptome dans les cellules et les tissus normaux et malades.

Malgré ces avancées en matière de RNA-seq, plusieurs caractéristiques techniques clés limitent la puissance quantitative de la méthode. Bien que la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN permettent une quantification précise et exacte des changements dans les niveaux d’ARN entre des variables expérimentales (c’est-à-dire des échantillons biologiques et/ou des états physiologiques), elles ne peuvent pas fournir de comparaisons quantitatives des niveaux de molécules d’ARN dans un échantillon. Par exemple, la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN ne peuvent pas quantifier avec précision le nombre relatif de copies de molécules isoaccepteurs d’ARNt individuelles dans un pool cellulaire d’ARNt exprimés. Comme souligné dans la publication^{complémentaire 7}, cette limitation du séquençage de l’ARN découle de plusieurs caractéristiques de la structure de l’ARN et de la biochimie de la préparation des banques. Par exemple, l’activité des enzymes de ligature utilisées pour fixer les liaisons de séquençage aux extrémités 3′ et 5′ aux molécules d’ARN est fortement influencée par l’identité des nucléotides terminaux de l’ARN et des liaisons de séquençage. Cela conduit à de grandes variations dans l’efficacité des ligatures de liaison et à de profondes augmentations artificielles des lectures de séquençage ^8,9,10.

Une deuxième série de limitations découle des propriétés structurelles inhérentes aux molécules d’ARN. Plus précisément, la formation de la structure secondaire de l’ARN et les changements dynamiques dans les dizaines de modifications post-transcriptionnelles de l’ARN de l’épitranscriptome peuvent provoquer une chute ou une mutation de la polymérase au cours de la transcription inverse. Ces erreurs entraînent une synthèse incomplète ou tronquée de l’ADNc ou une séquence d’ARN altérée. Bien que ces deux phénomènes puissent être exploités pour cartographier des structures secondaires ou certaines modifications, ils dégradent la précision quantitative du séquençage de l’ARN si les étapes ultérieures de préparation de la bibliothèque ne parviennent pas à capturer des ADNc tronqués ou si le traitement des données rejette des séquences mutées ne correspondant pas à un ensemble de données de référence^11,12. De plus, l’immense diversité chimique, de longueur et structurelle des transcrits d’ARN, ainsi que le manque d’outils pour fragmenter uniformément les ARN longs, diminuent l’applicabilité de la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN à toutes les espèces d’ARN¹³.

La méthode AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) a été développée pour lever plusieurs de ces contraintes techniques et biologiques qui limitent la précision quantitative⁷. En minimisant les biais dépendants de la séquence dans la capture, la ligature et l’amplification lors de la préparation de la bibliothèque de séquençage de l’ARN, AQRNA-seq atteint une linéarité supérieure par rapport aux autres méthodes, quantifiant avec précision 75 % d’une bibliothèque de référence de 963 miARN avec une précision 2 fois supérieure. Cette corrélation linéaire du nombre de lectures de séquençage et de l’abondance de l’ARN est également observée dans l’analyse d’un pool de longueurs variables d’étalons d’oligonucléotides d’ARN et en référence à des méthodes orthogonales comme le transfert de Northern. L’établissement de la linéarité entre le nombre de lectures de séquençage et l’abondance de l’ARN permet à l’AQRNA-seq d’obtenir une quantification précise et absolue de toutes les espèces d’ARN au sein d’un échantillon.

Voici une description du protocole pour le flux de travail de préparation de la bibliothèque AQRNA-seq et du pipeline d’analyse de données en aval qui l’accompagne. La méthode a été appliquée pour élucider la dynamique de l’abondance de l’ARNt pendant la dormance induite par la famine et la réanimation ultérieure dans le modèle de tuberculose du modèle de la tuberculose à Bacilles de Calmette et Guérin de Mycobacterium bovis . Les résultats ont été présentés pour la visualisation exploratoire des données de séquençage, ainsi que pour les analyses ultérieures de regroupement et d’expression différentielle qui ont révélé des modèles discernables dans l’abondance de l’ARNt associés à divers phénotypes.