마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용

CUT&Tag 분석은 ChIP¹의 몇 가지 명백한 결함을 보완하기 위해 발명되었습니다. ChIP의 두 가지 주요 단점은 1) 염색질을 단편화할 때 발생하는 바이어스와 2) 낮은 세포 수로 작업할 수 없다는 것입니다. X-ChIP 분석은 염색질 단편을 얻기 위해 초음파 처리 또는 MNase 분해에 의존하는 반면, N-ChIP는 주로 MNase 분해를 사용하여 뉴클레오솜을 얻습니다. 초음파 처리는 프로모터 영역²와 같은 이완 된 염색질 위치에 대한 편향을 보이며, 명백하게, MNase 소화는 또한 이완 된 염색질 섬유에서보다 효율적으로 작동합니다. 더욱이, 일부에서는 MNase 분해가 DNA 염기서열 의존성 편향(DNA sequence-dependent bias)을 나타낸다고 보고했다³. 따라서 ChIP 분석의 투입 준비 단계에서 모든 종류의 게놈 위치에서 완벽하게 무작위로 염색질 단편을 얻는 것은 불가능합니다. 또한 ChIP 분석은 일반적으로 CUT&Tag에 비해 더 높은 배경 신호를 생성하며 피크가^1,4,5인 위치를 강조하기 위해 CUT&Tag보다 10배 이상 더 많은 판독이 필요합니다. 이것은 ChIP 실험이 CUT&Tag보다 엄청나게 더 많은 세포로 시작해야 하는 이유를 설명합니다. 이것은 세포주를 연구할 때 매우 높은 세포 수를 달성하기 위해 반복적으로 통과할 수 있기 때문에 문제가 되지 않습니다. 그러나 ChIP 분석은 희귀하거나 귀중한 일차 세포 집단을 연구하기 위한 강력한 후성유전학적 도구는 아니지만, 일차 세포는 분명히 더 실용적이고 의학적인 의미를 가지고 있습니다.

길고 복잡한 ChIP 절차로 인해 일부 연구자들은 이 기법을 배우거나 사용하는 데 어려움을 겪지만, 사람들은 면역세포화학(ICC) 또는 면역형광(IF)과 같은 더 쉬운 분석에 더 편안함을 느낍니다. CUT&Tag 분석은 기본적으로 ICC 및 IF 실험 프로세스와 유사하지만 시험관에서만 수행됩니다. CUT&Tag는 처음부터 단편화된 염색질이 필요하지 않으며, 대신 항체 결합을 위해 게놈이 온전해야^{합니다 1}. ChIP 실험의 첫날, 연구자들은 일반적으로 짧은 염색질 조각을 항체 비드 ^4,5와 혼합하기 전에 초음파 처리 또는 MNase 소화를 통해 핵에서 단편화된 염색질을 준비하는 데 최대 4시간을 소비합니다. 이와는 대조적으로, CUT&Tag 절차의 첫날 작업량은 세포를 Concanavalin-A beads에 고정시킨 다음 cell-bead에 1차 항체를 추가하는 것입니다. ~40분만 필요합니다¹.

Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease(CUT&RUN)는 CUT&Tag의 중요한 대안이라는 점을 언급할 가치가 있습니다. CUT&RUN은 CUT&TAG와 유사한 작동 메커니즘을 기반으로 설립되었습니다. CUT&Tag에서 항체는 효소가 각각 염색질 조각을 잘라내고 동시에 라이브러리 제작 어댑터로 태그를 붙일 모든 위치로 pA/G-Tn5 전이효소를 안내하는 반면, CUT&RUN에서 pA/G-Tn5의 역할은 pA/G-MNase에 의해 수행되며 pA/G-MNase는 작업⁶의 절단 부분만 수행합니다. 그러므로, CUT&Tag와 비교하여, CUT&RUN은 라이브러리 제작 어댑터를 pA/G-MNase-단편화된 DNA 조각 ^7,8에 붙이는 추가 단계를 필요로 한다. CUT&Tag와 CUT&RUN의 높은 유사성으로 인해 CUT&TAG에 익숙한 연구원은 CUT&RUN을 능숙하게 수행하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 그러나 CUT&Tag와 CUT&RUN 사이에는 몇 가지 사소한 차이점이 있다는 점에 유의해야 합니다. CUT&RUN 프로토콜은 일반적으로 세척 단계에서 물리적 농도의 염(~150mM)을 사용하는 반면, CUT&Tag에서 300-Dig 세척 버퍼는 염분 함량이 높습니다. 따라서 CUT&Tag는 히스톤 표시/변이체 또는 전사 인자를 프로파일링할 때 이러한 단백질이 DNA¹에 직접적이고 강력하게 결합하기 때문에 배경을 제어하는 데 좋습니다. CUT&Tag는 DNA에 직접 결합하지 않고 염색질에 약한 친화력을 보이는 염색질 관련 인자를 프로파일링할 때 문제가 발생할 수 있습니다. CUT&Tag의 고염 세척 단계는 염색질 관련 인자를 제거하고 최종 출력에서 신호를 일으키지 않을 수 있습니다. CUT&Tag를 사용하여 일부 비히스톤/비전사 인자^{단백질을 프로파일}링할 수 있는 성공적인 사례가 있지만9, 여전히 약하게 결합된 염색질 관련 단백질을 프로파일링하기 위해 CUT&Tag보다 CUT&RUN을 권장합니다.

포유류가 성체가 된 후에도 골격근 조직에는 여전히 근육 줄기 세포가 포함되어 있습니다. 근육 손상 동안, 이들 줄기세포는 활성화되고 손상된 근육 섬유를 재생하기 위해 세포 수 확장 및 분화를 거칠 수 있다¹⁰. 이러한 줄기 세포는 근육 줄기/위성 세포(MuSC)로 알려져 있습니다. MuSC가 동물에서 분리되거나 근육 손상에 의해 활성화된 후에는 증식하기 시작하여 근아세포가 됩니다.

생쥐 골격근 분해물에서 MuSC를 얻기 위해 Vcam1(Cd106), Cd34 및 α7-integrin(Itga7)과 같은 MuSC 표면 마커는 종종 개별적으로 또는 조합하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 중에 MuSC를 농축하는 데 사용됩니다¹¹. Cd31^–/Cd45^–/Sca1^–/Vcam1⁺ 는 아마도 >95% 순수 MuSCs를 얻기 위한 최상의 마커 조합일 것으로 나타났다¹². FACS는 신선한 근육이 소화된 직후 순수한 MuSC를 분리할 수 있습니다. 그러나 실험 설계에서 분리 바로 순수한 MuSC가 필요하지 않은 경우 >90% 순수 근아세포(MuSC 자손)를 얻기 위해 사전 도금이 FACS보다 비용 효율적입니다.

생쥐에서 갓 분리한 MuSC는 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Ham의 F10 배지에서 효율적으로 증식하지 않습니다. MuSC의 세포 수를 더 잘 확장하고 충분한 근아세포를 얻으려면 FBS 대신 소 성장 혈청(BGS)을 사용해야 합니다. 그러나, BGS를 이용할 수 없는 경우, Ham의 F10 전체 배지(약 20% FBS 포함)를 동일한 부피의 T-세포 조건부 배지와 혼합하여 근모세포 확장을 극적으로 촉진할 수 있다¹³. 따라서, 이 프로토콜은 또한 T-세포 배지 컨디셔닝된 MuSC 배지의 제조에 대해 설명할 것이다.

가장 중요한 것은 이 프로토콜이 쥐 뒷다리 근육에서 분리된 쥐 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 완전한 예를 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형과 히스톤 마크 및 히스톤 변이체에도 적용되며, 독자는 연구하는 특정 히스톤 마크 또는 변이체의 농축을 기반으로 자신의 사례에 대한 세포 수 또는 항체 양을 최적화하기만 하면 됩니다.

CUT&Tag 또는 CUT&RUN에 사용되려면 Tn5 또는 MNase를 단백질 A 또는 단백질 G와 융합하여 pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase 또는 pG-MNase를 만들어야 합니다. 명백하게, 단백질 A와 단백질 G는 둘 다 pA/G-Tn5 또는 pA/G-MNase를 생성하기 위하여 이 효소에 동시에 융합될 수 있습니다. 단백질 A와 단백질 G는 서로 다른 종의 IgG에 대한 차별적 친화력을 보여줍니다. 따라서 단백질 A와 단백질 G를 효소에 모두 융합하면 이 문제를 극복하고 효소가 여러 종의 항체와 호환되도록 만들 수 있습니다.