Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

CUT&Tagアッセイは、^{ChIPs 1}の明らかな欠陥を補うために考案されました。ChIPの2つの大きな欠点は、1)クロマチンを断片化する際に生じるバイアスと、2)低い細胞数での作業ができないことです。X-ChIPアッセイは、クロマチンフラグメントを取得するために超音波処理またはMNase消化のいずれかに依存していますが、N-ChIPは主にMNase消化を使用してヌクレオソームを取得します。超音波処理は、プロモーター領域²のような弛緩したクロマチン位置に偏りを示しており、明らかに、MNase消化は弛緩したクロマチン繊維に対してもより効率的に機能します。また、MNaseの消化にもDNA配列依存的なバイアスが見られるとの報告もありました³。したがって、ChIPアッセイのインプット調製ステップでは、あらゆる種類のゲノム位置から完全にランダムな方法でクロマチンフラグメントを取得することは不可能です。さらに、ChIPアッセイは通常、CUT&Tagよりも高いバックグラウンドシグナルを生成し、ピークが^1,4,5である場所を強調するためにCUT&Tagよりも10倍以上のリードを必要とします。これが、ChIP実験がCUT&Tagよりもはるかに多くの細胞から始めなければならない理由を説明しています。細胞株を研究する際には、細胞株を繰り返し継代して非常に高い細胞数を達成できるため、これは問題になりません。しかし、ChIPアッセイは、希少なまたは貴重な初代細胞集団を研究するための強力なエピジェネティックなツールではないことは確かですが、初代細胞の方がより実用的で医学的な意味合いを持っていることは明らかです。

長くて複雑なChIP手順により、一部の研究者はこの手法を学んだり使用したりすることを思いとどまらせますが、人々は免疫細胞化学(ICC)や免疫蛍光(IF)などの簡単なアッセイに慣れています。CUT&Tagアッセイは、基本的にICCおよびIF実験のプロセスに似ていますが、試験管内でのみ行われます。CUT&Tagは、そもそも断片化されたクロマチンを必要とせず、代わりに、抗体結合¹のためにゲノムが無傷でなければなりません。ChIP実験の初日、研究者は通常、短いクロマチン片を抗体ビーズと混合する前に、ソニケーションまたはMNase消化で核から断片化されたクロマチンを調製するのに最大4時間を費やします^4,5。これとは対照的に、CUT&Tag法の初日の作業負荷は、細胞をConcanavalin-Aビーズに固定し、その後、細胞ビーズに一次抗体を添加することです。これには ~40 分¹ しか必要ありません。

特筆すべきは、Cleavage Under TargetsおよびRelease Using Nuclease(CUT&RUN)がCUT&Tagの重要な代替手段であることです。CUT&RUNは、CUT&Tagと同様の動作メカニズムに基づいて設立されました。CUT&Tagでは、抗体がpA/G-Tn5トランスポゼースをすべての場所に誘導し、酵素がそれぞれクロマチンの一部を切り取り、その間にライブラリ作製アダプターでタグを付けますが、CUT&RUNでは、pA/G-Tn5の役割は、ジョブの切断部分のみを実行するpA/G-MNaseによって果たされます⁶。そのため、CUT&Tagと比較すると、CUT&RUNでは、pA/G-MNaseで断片化されたDNA断片^7,8にライブラリー作製アダプターを接着する追加工程が必要になります。CUT&TagとCUT&RUNは類似性が高いため、CUT&Tagに精通した研究者は、CUT&RUNを上手に行うことに容易に適応することができます。ただし、CUT&TagとCUT&RUNには若干の違いがあります。CUT&RUNのプロトコルでは、通常、洗浄ステップで物理濃度の塩 (~150 mM) を使用しますが、CUT&Tagでは、300-Dig洗浄バッファーの塩分が多く含まれています。したがって、CUT&Tagは、ヒストンマーク/バリアントまたは転写因子をプロファイリングする際にバックグラウンドを制御するのが得意で、これらのタンパク質は^DNA1に直接かつ強力に結合します。CUT&Tagは、DNAに直接結合せず、クロマチンに対して弱い親和性を示すクロマチン関連因子をプロファイリングする際に問題に遭遇する可能性があります。CUT&Tagの高塩分洗浄ステップでは、クロマチン関連因子が取り除かれ、最終出力にシグナルが生成されない可能性があります。CUT&Tagを使用して非ヒストン/非転写因子タンパク質9をプロファイリングできる成功例もあります^が、弱く結合したクロマチン関連タンパク質のプロファイリングには、CUT&TagよりもCUT&RUNをお勧めします。

哺乳類が成体に達した後も、その骨格筋組織にはまだ筋幹細胞が含まれています。筋肉損傷の間、これらの幹細胞は活性化され、細胞数の拡大および分化を受けて損傷した筋線維^{を再生することができる10}。これらの幹細胞は、筋幹細胞/衛星細胞(MuSC)として知られています。MuSCは動物から単離された後、または筋肉の損傷によって活性化された後、増殖を開始し、筋芽細胞になります。

マウス骨格筋消化物からMuSCを得るために、Vcam1(Cd106)、Cd34、α7-インテグリン(Itga7)などのMuSC表面マーカーを個々に、または組み合わせて使用して、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)¹¹中にMuSCを濃縮することがよくあります。Cd31^–/Cd45^–/Sca1^–/Vcam1⁺ は、おそらく>95%の純粋なMuSCを得るための最良のマーカーの組み合わせであることが示されています¹²。FACSは、新鮮な筋肉が消化された直後に純粋なMuSCを分離することができます。しかし、実験デザインが純粋なMuSCを分離する必要がない場合、プレプレーティングはFACSよりも費用対効果が高く、>90%の純粋な筋芽細胞(MuSC子孫)を得ることができます。

マウスから新たに単離されたMuSCは、ウシ胎児血清(FBS)を添加したハムのF10培地では効率的に増殖しません。MuSCの細胞数をより多く増やし、十分な筋芽細胞を得るためには、FBSの代わりにウシ成長血清(BGS)を使用すべきである。しかし、BGSが利用できない場合は、ハムのF10フル培地(約20%のFBSを含む)を等量のT細胞条件付き培地と混合して、筋芽細胞の増殖を劇的に促進することができる¹³。したがって、このプロトコルでは、T細胞培地コンディショニングMuSC培地の調製についても説明します。

最も重要なことは、このプロトコールは、マウス後肢筋から単離されたマウス筋芽細胞に対してH3K4me1 CUT&Tagアッセイを実施する完全な例を提供することです。このプロトコルは、他の細胞タイプやヒストンマーク、ヒストンバリアントにも適用され、読者は、研究する特定のヒストンマークやバリアントの濃縮に基づいて、自分のケースの細胞数や抗体量を最適化するだけでよいことにご注意ください。

CUT&TagまたはCUT&RUNで使用するには、Tn5またはMNaseをプロテインAまたはプロテインGと融合させて、pA-Tn5、pG-Tn5、pA-MNase、またはpG-MNaseを生成する必要があります。明らかに、プロテインAとプロテインGの両方をこれらの酵素に同時に融合させて、pA/G-Tn5またはpA/G-MNaseを生成することができるようです。プロテインAとプロテインGは、異なる種由来のIgGに対して異なる親和性を示します。したがって、プロテインAとプロテインGを酵素に融合させることで、この問題を克服し、酵素を複数の生物種の抗体と適合させることができます。