Summary

Caractérisation comportementale d’un modèle murin du syndrome d’Angelman

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Ce manuscrit présente un ensemble de tests comportementaux hautement reproductibles pour valider un modèle murin du syndrome d’Angelman.

Abstract

Ce manuscrit décrit une batterie de tests comportementaux disponibles pour caractériser les phénotypes de type syndrome d’Angelman (SA) dans un modèle murin établi de SA. Nous utilisons le paradigme d’apprentissage du rotarod, l’analyse détaillée de la démarche et le test de construction du nid pour détecter et caractériser les déficiences motrices des animaux. Nous testons l’émotivité de l’animal en plein champ et dans les tests de labyrinthe surélevé, ainsi que l’effet dans le test de suspension de la queue. Lorsque des souris AS sont testées dans le cadre du test en champ libre, les résultats doivent être interprétés avec prudence, car les dysfonctionnements moteurs influencent le comportement de la souris dans le labyrinthe et modifient les scores d’activité.

La reproductibilité et l’efficacité des tests comportementaux présentés ont déjà été validées dans plusieurs lignées de souris Uba3a indépendantes avec différentes variantes knock-out, faisant de cet ensemble de tests un excellent outil de validation dans la recherche sur la SA. Les modèles avec la construction pertinente et la validité apparente justifieront des recherches plus approfondies pour élucider la physiopathologie de la maladie et permettre le développement de traitements causaux.

Introduction

Le syndrome d’Angelman (SA) est une maladie neurodéveloppementale rare. L’origine génétique la plus fréquente de la SA est une délétion importante de la région 15q11-q13 du chromosome d’origine maternelle, qui se retrouve chez près de 74 % des patients1. La délétion de cette région entraîne la perte d’UBE3A, le principal gène responsable de la SA qui code pour une ubiquitine ligase E3. L’allèle paternel du gène UBE3A dans les neurones est réduit au silence dans un processus connu sous le nom d’empreinte. En conséquence, l’empreinte paternelle du gène ne permet que l’expression maternelle dans le système nerveux central (SNC)2. Par conséquent, la délétion du gène UBE3A du chromosome d’origine maternelle entraîne le développement de symptômes de la SA. Chez l’homme, la SA se manifeste vers l’âge de 6 mois, avec un retard de développement qui persiste à tous les stades du développement et se traduit par des symptômes débilitants sévères chez les personnes atteintes 3,4. Les principaux symptômes de la maladie comprennent le déficit de la motricité fine et globale, y compris une démarche ataxique saccadée, de graves troubles de la parole et une déficience intellectuelle. Environ 80 % des patients atteints de SA souffrent également de troubles du sommeil et d’épilepsie. À ce jour, les seuls traitements disponibles sont les médicaments symptomatiques, qui réduisent les crises d’épilepsie et améliorent la qualité du sommeil1. Par conséquent, le développement de modèles animaux robustes avec des phénotypes comportementaux reproductibles ainsi qu’une analyse de phénotypage affinée seront essentiels pour élucider les mécanismes physiopathologiques de la maladie et découvrir des médicaments et des traitements efficaces.

La complexité du trouble humain affectant le SNC exige que les organismes modèles possèdent un génome, une physiologie et un comportement comparables. Les souris sont populaires en tant qu’organisme modèle en raison de leur cycle de reproduction court, de leur petite taille et de leur relative facilité de modification de l’ADN. En 1984, Paul Willner a proposé trois critères de base de validation du modèle de maladie : la construction, la face et la validité prédictive, qui sont utilisés pour déterminer la valeur du modèle5. Simplement, la validité conceptuelle reflète les mécanismes biologiques responsables du développement du trouble, la validité faciale récapitule ses symptômes et la validité prédictive décrit la réponse du modèle aux médicaments thérapeutiques.

Pour adhérer aux principes ci-dessus, nous avons choisi l’étiologie génétique la plus courante, une grande délétion du locus maternel 15q11.2-13q, y compris le gène UBE3A, pour créer des souris modèles AS. Nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour supprimer une région de 76 225 pb de long couvrant l’ensemble du gène UBE3A, englobant à la fois les éléments codants et non codants du gène, chez des souris issues d’un fond C57BL/6N6. Nous avons ensuite croisé les animaux pour obtenir des souris hétérozygotes UBE3A+/−. Pour la validation faciale du modèle, nous avons utilisé des animaux issus de croisements de femelles UBE3A+/− et de mâles de type sauvage pour obtenir la descendance UBE3A+/- (souche nommée C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph et plus tard assignée sous le nom de UBE3A mGenedel/+) et des compagnons de portée témoins. Nous avons testé leur motricité fine et globale, leur émotivité et leur affect pour récapituler les principaux symptômes de la SA. Dans un article précédent, nous avons également évalué les fonctions cognitives des animaux, car les patients atteints de SA souffrent également de déficience intellectuelle6. Cependant, nous n’avons trouvé aucune déficience cognitive chez les souris UBE3AmGenedel/+, peut-être en raison du jeune âge des animaux au moment des tests7. Un examen ultérieur des animaux plus âgés, âgés d’environ 18 semaines, a révélé un déficit de flexibilité comportementale lors de l’apprentissage inversé dans le paradigme de préférence de lieu. Cependant, la complexité de l’équipement utilisé pour cette analyse nécessite un module méthodologique distinct et il n’est pas inclus ici.

Les tests comportementaux présentés ici font partie des outils de phénotypage les plus courants dans la recherche génétique, grâce à leur haute valeur prédictive et à leur validité de construction suffisante 8,9,10. Nous avons utilisé ces tests pour valider un modèle murin de SA en récapitulant les principaux symptômes de la maladie humaine d’une manière reproductible et indépendante de l’âge. L’émotivité de l’animal a été évaluée dans le labyrinthe surélevé et les tests en plein champ. Ces deux tests sont basés sur le conflit approche-évitement, où les animaux explorent un nouvel environnement à la recherche de nourriture, d’un abri ou d’opportunités d’accouplement tout en évitant simultanément les compartiments anxiogènes11. De plus, le test en champ ouvert est utilisé pour tester l’activité locomotriced’une souris 8. Le test de suspension de la queue est largement utilisé dans la recherche sur la dépression pour dépister de nouveaux médicaments antidépresseurs ou des phénotypes de type dépressif dans des modèles de souris knock-out12. Ce test évalue le désespoir que les animaux développent au fil du temps dans une situation inéluctable. L’apprentissage moteur et les caractéristiques détaillées de la marche ont été déterminés sur le rotarod et sur DigiGait, respectivement. L’endurance de l’animal sur la tige d’accélération caractérise ses capacités d’équilibre et de coordination des mouvements, tandis que l’analyse détaillée des schémas de pas d’une souris est une évaluation sensible des déficiences neuromusculaires liées à de nombreux troubles neurogénératifs du mouvement13,14,15. Le test de déchiquetage des nids fait partie de la méthodologie standard de détection du comportement impulsif chez les rongeurs, et comme il utilise le comportement naturel des rongeurs, il indique le bien-être de l’animal16,17.

La taille des groupes expérimentaux a été le résultat d’un compromis pour répondre aux exigences de la règle des 3R et à l’utilisation efficace des performances de reproduction des colonies. Cependant, pour obtenir une puissance statistique, les groupes ne comptaient pas moins de 10 individus, en raison de l’établissement d’un nombre suffisant de couples reproducteurs. Malheureusement, les performances d’élevage n’ont pas toujours permis d’obtenir un nombre suffisant d’animaux.

Protocol

Tous les animaux et les expériences utilisés dans cette étude ont fait l’objet d’un examen éthique et ont été menés conformément à la directive européenne 2010/63/UE. L’étude a été approuvée par la Commission centrale tchèque pour le bien-être des animaux. Les souris ont été logées dans des cages ventilées individuellement et maintenues à une température constante de 22 ± 2 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les souris ont reçu de la nourriture de souris et de l’eau ad libi…

Representative Results

Tests en hauteur, en labyrinthe et en champ libreLes tests EPM et OF utilisent la tendance naturelle des rongeurs à explorer de nouveaux environnements18,19. L’exploration est régie par un conflit d’approche-évitement, où les rongeurs choisissent entre l’exploration d’un nouvel environnement et l’évitement d’un éventuel danger. Les animaux explorent des endroits inconnus à la recherche d’un abri, de contacts sociaux ou de…

Discussion

Les modèles SA créés dans différentes souches murines sont généralement validés par des tests de l’état émotionnel, des fonctions motrices et des capacités cognitives de l’animal pour faciliter la comparaison avec les symptômes humains31,32. Un déficit moteur dans les modèles SA est la constatation la plus constante dans tous les laboratoires, suivi d’un état d’émotivité inchangé des mutants et de difficultés à construire des nids<sup c…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par le RVO 68378050 de l’Académie tchèque des sciences, LM2018126 Centre tchèque de phénogénomique fourni par le MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Mise à niveau du Centre tchèque de phénogénomique : développement vers la recherche translationnelle par MEYS et ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (mise à niveau de l’infrastructure CCP II par MEYS et ESIF) et OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (amélioration de la qualité et de la capacité des modèles transgéniques par MEYS et ERDF). En outre, cette étude a reçu un financement de l’ONG « Association of Gene Therapy (ASGENT) », de la Tchéquie (https://asgent.org/) et LM2023036 Centre tchèque de phénogénomique fourni par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

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Diesen Artikel zitieren
Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

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