Caracterización conductual de un modelo de ratón con síndrome de Angelman

El síndrome de Angelman (EA) es una enfermedad rara del neurodesarrollo. El origen genético más común de la EA es una gran deleción de la región 15q11-q13 del cromosoma de origen materno, que se encuentra en casi el 74% de los pacientes¹. La deleción de esta región provoca la pérdida de UBE3A, el principal gen causante de la EA que codifica una ubiquitina ligasa E3. El alelo paterno del gen UBE3A en las neuronas se silencia en un proceso conocido como impronta. Como consecuencia, la impronta paterna del gen solo permite la expresión materna en el sistema nervioso central (SNC)². Por lo tanto, la deleción del gen UBE3A del cromosoma derivado de la madre conduce al desarrollo de síntomas de EA. En los seres humanos, la EA se manifiesta alrededor de los 6 meses de edad, con un retraso en el desarrollo que persiste a lo largo de todas las etapas del desarrollo y da lugar a síntomas debilitantes graves en los individuos afectados ^3,4. Los síntomas centrales del trastorno incluyen el déficit de habilidades motoras finas y gruesas, incluida la marcha atáxica espasmódica, el deterioro grave del habla y la discapacidad intelectual. Aproximadamente el 80% de los pacientes con EA también sufren trastornos del sueño y epilepsia. Hasta la fecha, el único tratamiento disponible son los fármacos sintomáticos, que reducen las crisis epilépticas y mejoran la calidad del sueño¹. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales robustos con fenotipos conductuales reproducibles junto con un análisis de fenotipado refinado será esencial para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos del trastorno y descubrir medicamentos y tratamientos efectivos.

La complejidad del trastorno humano que afecta al SNC exige que los organismos modelo posean un genoma, una fisiología y un comportamiento comparables. Los ratones son populares como organismo modelo debido a su corto ciclo reproductivo, tamaño pequeño y relativa facilidad de modificación del ADN. En 1984, Paul Willner propuso tres criterios básicos de validación del modelo de enfermedad: el constructo, la cara y la validez predictiva, que se utilizan para determinar el valor del modelo⁵. Simplemente, la validez de constructo refleja los mecanismos biológicos responsables del desarrollo del trastorno, la validez facial recapitula sus síntomas y la validez predictiva describe la respuesta del modelo a los fármacos terapéuticos.

Para adherirnos a los principios anteriores, hemos elegido la etiología genética más común, una gran deleción del locus materno 15q11.2-13q, incluido el gen UBE3A, para crear ratones modelo de EA. Utilizamos la técnica CRISPR/Cas9 para eliminar una región de 76.225 pb de largo que abarca todo el gen UBE3A, que abarca tanto los elementos codificantes como los no codificantes del gen, en ratones de un fondo C57BL/6N⁶. A continuación, criamos los animales para obtener ratones heterocigotos UBE3A^+/−. Para la validación facial del modelo, utilizamos animales de cruces de hembras UBE3A+/⁻ y machos de tipo salvaje para obtener progenie UBE3A+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph y posteriormente asignada como UBE3A ^mGenedel/+) y compañeros de camada de control. Evaluamos sus habilidades motoras finas y gruesas, su emocionalidad y su afecto para recapitular los síntomas centrales de la EA. En un artículo anterior, también evaluamos las funciones cognitivas de los animales, ya que los pacientes con EA también sufren de discapacidad intelectual⁶. Sin embargo, no encontramos alteraciones cognitivas en los ratones UBE3A^mGenedel/+, tal vez debido a la corta edad de los animales en el momento de la prueba⁷. Un examen posterior de los animales más viejos, alrededor de las 18 semanas de edad, reveló un déficit en la flexibilidad conductual durante el aprendizaje inverso en el paradigma de preferencia de lugar. Sin embargo, la complejidad de los equipos empleados para este análisis requiere un módulo metodológico separado y no se incluye aquí.

Las pruebas conductuales aquí presentadas pertenecen a las herramientas de fenotipado comunes en la investigación genética, gracias a su alto valor predictivo y suficiente validez de constructo 8,9,10. Utilizamos estas pruebas para validar un modelo murino de EA recapitulando los síntomas centrales de la enfermedad humana de una manera reproducible e independiente de la edad. La emocionalidad del animal se evaluó en las pruebas de laberinto elevado plus y campo abierto. Ambas pruebas se basan en el conflicto de acercamiento-evitación, en el que los animales exploran un nuevo entorno en busca de alimento, refugio u oportunidades de apareamiento, al tiempo que evitan los compartimentos ansiogénicos¹¹. Además, la prueba de campo abierto se utiliza para probar la actividad locomotora de un ratón⁸. La prueba de suspensión de la cola se utiliza ampliamente en la investigación de la depresión para detectar nuevos fármacos antidepresivos o fenotipos similares a los depresivos en modelos de ratón knockout¹². Esta prueba evalúa la desesperación que desarrollan los animales con el paso del tiempo en una situación ineludible. El aprendizaje motor y las características detalladas de la marcha se determinaron en el rotarod y en el DigiGait, respectivamente. La resistencia animal en la varilla aceleradora caracteriza sus habilidades de equilibrio y coordinación de movimientos, mientras que el análisis detallado de los patrones de pasos de un ratón es una evaluación sensible de las deficiencias neuromusculares relacionadas con muchos trastornos neurogenerativos del movimiento^13,14,15. La prueba de trituración de nidos es parte de la metodología estándar para detectar el comportamiento impulsivo en roedores y, dado que utiliza el comportamiento natural de construcción de roedores, indica el bienestar del animal^16,17.

El tamaño de los grupos experimentales fue el resultado de un compromiso para cumplir con las demandas de la regla de las 3R y el uso eficiente del rendimiento genético de las colonias. Sin embargo, para obtener poder estadístico, los grupos tuvieron no menos de 10 individuos, debido al establecimiento de una cantidad suficiente de parejas reproductoras. Desafortunadamente, el rendimiento reproductivo no siempre resultó en un número suficiente de animales.