Summary

Gedragskarakterisering van een Angelman Syndroom Muismodel

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Dit manuscript presenteert een reeks zeer reproduceerbare gedragstests om een muismodel met het Angelman-syndroom te valideren.

Abstract

Dit manuscript beschrijft een reeks gedragstests die beschikbaar zijn om angelmansyndroom (AS) -achtige fenotypen te karakteriseren in een gevestigd muizenmodel van AS. We gebruiken het rotarod-leerparadigma, gedetailleerde loopanalyse en nestbouwtest om motorische beperkingen bij dieren te detecteren en te karakteriseren. We testen de emotionaliteit van dieren in het open veld en verhoogde plus doolhoftests, evenals het effect in de staartsuspensietest. Wanneer AS-muizen worden getest in de open veldtest, moeten de resultaten met zorg worden geïnterpreteerd, omdat motorische disfuncties het gedrag van muizen in het doolhof beïnvloeden en de activiteitsscores veranderen.

De reproduceerbaarheid en effectiviteit van de gepresenteerde gedragstests is al gevalideerd in verschillende onafhankelijke Uba3a-muislijnen met verschillende knock-outvarianten, waardoor deze reeks tests een uitstekend validatie-instrument is in AS-onderzoek. Modellen met de relevante constructie en gezichtsvaliditeit zullen verder onderzoek rechtvaardigen om de pathofysiologie van de ziekte op te helderen en de ontwikkeling van causale behandelingen toe te staan.

Introduction

Angelman syndroom (AS) is een zeldzame neurologische ontwikkelingsziekte. De meest voorkomende genetische oorsprong van AS is een grote deletie van het 15q11-q13-gebied van het maternale chromosoom, dat wordt aangetroffen bij bijna 74% van de patiënten1. Deletie van dit gebied veroorzaakt het verlies van UBE3A, het belangrijkste oorzakelijke gen van AS dat codeert voor een E3-ubiquitineligase. Het vaderlijke allel van het UBE3A-gen in neuronen wordt tot zwijgen gebracht in een proces dat bekend staat als imprinting. Als gevolg hiervan staat vaderlijke inprenting van het gen alleen maternale expressie in het centrale zenuwstelsel (CZS)2 toe. Daarom leidt UBE3A-gendeletie van het maternale chromosoom tot de ontwikkeling van AS-symptomen. Bij mensen manifesteert AS zich rond de leeftijd van 6 maanden, met ontwikkelingsachterstand die aanhoudt in alle ontwikkelingsstadia en resulteert in ernstige slopende symptomen bij getroffen personen 3,4. De kernsymptomen van de aandoening zijn het tekort aan fijne en grove motoriek, waaronder schokkerige ataxische gang, ernstige spraakstoornissen en intellectuele achterstand. Ongeveer 80% van de AS-patiënten lijdt ook aan slaapstoornissen en epilepsie. Tot op heden zijn de enige beschikbare behandelingen symptomatische geneesmiddelen, die epileptische aanvallen verminderen en de slaapkwaliteit verbeteren1. Daarom zal de ontwikkeling van robuuste diermodellen met reproduceerbare gedragsfenotypen naast verfijnde fenotyperingsanalyse essentieel zijn om de pathofysiologische mechanismen van de aandoening op te helderen en effectieve medicijnen en behandelingen te ontdekken.

De complexiteit van de menselijke aandoening die het CZS beïnvloedt, vereist dat modelorganismen een vergelijkbaar genoom, fysiologie en gedrag bezitten. Muizen zijn populair als modelorganisme vanwege hun korte voortplantingscyclus, kleine omvang en relatief gemak van DNA-modificatie. In 1984 stelde Paul Willner drie basisvalidatiecriteria voor ziektemodellen voor: de construct, het gezicht en de voorspellende validiteit, die worden gebruikt om de waarde van het modelte bepalen 5. Simpel gezegd, constructvaliditeit weerspiegelt de biologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van de stoornis, gezichtsvaliditeit vat de symptomen samen en voorspellende validiteit beschrijft de modelrespons op therapeutische geneesmiddelen.

Om aan de bovenstaande principes te voldoen, hebben we de meest voorkomende genetische etiologie gekozen, een grote deletie van de maternale 15q11.2-13q-locus inclusief het UBE3A-gen, om AS-modelmuizen te creëren. We gebruikten de CRISPR/Cas9-techniek om een 76.225 bp lang gebied te verwijderen dat het hele UBE3A-gen beslaat, dat zowel de coderende als niet-coderende elementen van het gen omvat, bij muizen met een C57BL/6N-achtergrond6. Vervolgens hebben we de dieren gefokt om UBE3A+/− heterozygote muizen te verkrijgen. Voor gezichtsvalidatie van het model gebruikten we dieren van kruisingen van UBE3A+/ vrouwtjes en wild-type mannetjes om UBE3A+/- nakomelingen te krijgen (stam genaamd C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph en later toegewezen als UBE3A mGenedel/+) en controle nestgenoten. We testten hun fijne en grove motoriek, emotionaliteit en affect om de kern AS-symptomen samen te vatten. In een vorig artikel evalueerden we ook de cognitieve functies van de dieren, omdat AS-patiënten ook lijden aan een verstandelijke beperking6. We vonden echter geen cognitieve stoornissen bij UBE3AmGenedel/+ muizen, misschien als gevolg van de jonge leeftijd van de dieren op het moment van testen7. Later onderzoek van de oudere dieren, ongeveer 18 weken oud, onthulde een tekort aan gedragsflexibiliteit tijdens omkeringsleren in het plaatsvoorkeurparadigma. De complexiteit van de gebruikte apparatuur voor deze analyse vereist echter een afzonderlijke methodologische module en deze is hier niet opgenomen.

De hier gepresenteerde gedragstests behoren tot de gebruikelijke fenotyperingsinstrumenten in genetisch onderzoek, dankzij hun hoge voorspellende waarde en voldoende constructvaliditeit 8,9,10. We gebruikten deze tests om een muismodel van AS te valideren door kernsymptomen van de menselijke ziekte op een reproduceerbare, leeftijdsonafhankelijke manier samen te vatten. De emotionaliteit van het dier werd geëvalueerd in de verhoogde plus doolhof en open veld tests. Beide tests zijn gebaseerd op het benaderingsvermijdingsconflict, waarbij dieren een nieuwe omgeving verkennen op zoek naar voedsel, onderdak of paringsmogelijkheden en tegelijkertijd anxiogene compartimenten vermijden11. Daarnaast wordt de open veld test gebruikt om de locomotorische activiteit van een muis te testen8. De staartsuspensietest wordt veel gebruikt in depressieonderzoek om te screenen op nieuwe antidepressiva of depressieve fenotypen in knock-outmodellen van muizen12. Deze test evalueert de wanhoop die dieren in de loop van de tijd ontwikkelen in een onontkoombare situatie. Motorisch leren en gedetailleerde loopkarakteristieken werden respectievelijk bepaald op de rotarod en in DigiGait. Het uithoudingsvermogen van dieren op de versnellende staaf kenmerkt zijn evenwichts- en bewegingscoördinatievaardigheden, terwijl gedetailleerde analyse van de stappatronen van een muis een gevoelige evaluatie is van neuromusculaire stoornissen die verband houden met vele neurogeneratieve bewegingsstoornissen13,14,15. De nestjesversnipperringstest maakt deel uit van de standaardmethodologie voor het detecteren van impulsief gedrag bij knaagdieren, en omdat het gebruik maakt van natuurlijk knaagdierbouwgedrag, geeft het het welzijn van het dier aan16,17.

De grootte van de experimentele groepen was het resultaat van een compromis om te voldoen aan de eisen van de 3R-regel en efficiënt gebruik van kolonie-fokprestaties. Om statistische kracht te verkrijgen, hadden de groepen echter niet minder dan 10 individuen, vanwege de oprichting van een voldoende aantal broedparen. Helaas resulteerden fokprestaties niet altijd in voldoende dieren.

Protocol

Alle dieren en experimenten die in dit onderzoek zijn gebruikt, hebben een ethische beoordeling ondergaan en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU. De studie werd goedgekeurd door de Tsjechische Centrale Commissie voor Dierenwelzijn. Muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien en op een constante temperatuur van 22 ± 2 °C gehouden met een licht/donkercyclus van 12 uur. De muizen werden voorzien van muizenchow en water ad libitum. De muizen werden gehuisvest in…

Representative Results

Verhoogd plus doolhof en open veld testenDe EPM- en OF-tests gebruiken de natuurlijke neiging van knaagdieren om nieuwe omgevingen te verkennen18,19. De verkenning wordt beheerst door een benadering-vermijdingsconflict, waarbij knaagdieren kiezen tussen het verkennen van een nieuwe omgeving en het vermijden van mogelijk gevaar. Dieren verkennen onbekende plaatsen op zoek naar beschutting, sociaal contact of foerageren. Nieuwe plaatsen kunnen …

Discussion

AS-modellen gemaakt in verschillende muizenstammen worden vaak gevalideerd met tests van de emotionele toestand van dieren, motorische functies en cognitieve vaardigheden om vergelijking met menselijke symptomen te vergemakkelijken31,32. Een motorisch tekort in AS-modellen is de meest consistente bevinding in laboratoria, gevolgd door een onveranderde emotionaliteitstoestand van mutanten en problemen met het bouwen van nesten31,32,33<…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door de Tsjechische Academie van Wetenschappen RVO 68378050, LM2018126 Tsjechisch Centrum voor Fenogenomics van MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade of the Czech Centre for Phenogenomics: developing towards translation research by MEYS and ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS and ESIF), en OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (hogere kwaliteit en capaciteit voor transgene modellen door MEYS en EFRO). Daarnaast ontving deze studie financiering van de NGO “Association of Gene Therapy (ASGENT)”, Tsjechië (https://asgent.org/) en LM2023036 Tsjechisch Centrum voor Fenogenomics van het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

Referenzen

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

View Video