Summary

Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

Published: February 24, 2023
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Summary

O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.

Abstract

Drosophila melanogaster é um organismo modelo ideal para o estudo de várias doenças devido à sua abundância de técnicas avançadas de manipulação genética e diversas características comportamentais. A identificação de deficiência comportamental em modelos animais é uma medida crucial da gravidade da doença, por exemplo, em doenças neurodegenerativas, onde os pacientes frequentemente experimentam prejuízos na função motora. No entanto, com a disponibilidade de vários sistemas para rastrear e avaliar déficits motores em modelos de moscas, como indivíduos tratados com drogas ou transgênicos, ainda falta um sistema econômico e fácil de usar para avaliação precisa de múltiplos ângulos. Desenvolve-se aqui um método baseado na interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, para avaliar sistematicamente as atividades de movimento de indivíduos adultos e larvais a partir de vídeos gravados, permitindo assim a análise de seu comportamento de rastreamento. Este método requer apenas uma câmera de alta definição e uma integração de hardware periférico de computador para gravar e analisar o comportamento, tornando-se uma abordagem acessível e eficaz para a triagem de modelos de moscas com deficiências comportamentais transgênicas ou ambientais. Exemplos de testes comportamentais usando moscas tratadas farmacologicamente são dados para mostrar como as técnicas podem detectar mudanças comportamentais em moscas adultas e larvas de maneira altamente repetível.

Introduction

Drosophila melanogaster fornece um excelente organismo modelo para investigar funções celulares e moleculares em modelos de doenças neuronais criadas por modificação gênica1, tratamento medicamentoso2 e senescência3. A alta conservação de vias biológicas, propriedades físicas e genes homólogos associados a doenças entre humanos e Drosophila torna a mosca-da-fruta uma mimética ideal desde o nível molecular até o comportamental4. Em muitos modelos de doenças, a deficiência comportamental é um índice importante, fornecendo um modelo útil para várias neuropatias humanas 5,6. Atualmente, a drosófila é utilizada no estudo de múltiplas doenças humanas, do neurodesenvolvimento e de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica7,8. A detecção da habilidade motora dos modelos de doença é crucial para a compreensão do progresso patogênico e pode fornecer uma correlação fenotípica com os mecanismos moleculares subjacentes ao processo da doença.

Recentemente, ferramentas de software disponíveis comercialmente e programas de baixo custo têm sido desenvolvidos para estratégias de detecção locomotora de Drosophila, tais como testes de alto rendimento em moscas agrupadas9,10 e mensuração da locomoção em tempo real11,12. Uma dessas abordagens convencionais é a geotáxi negativa interativa rápida (RING), também chamada de ensaio de escalada, que inclui múltiplos canais que permitem conter uma grande população de moscas com o mesmo sexo e idade, reduzindo a variação durante a coleta de dados 9,13. Outro método de pré-teste para análise do comportamento locomotor é o TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), um dispositivo que utiliza múltiplos feixes para detectar o movimento da atividade das moscas dentro de um tubo de vidro fino14. O aparelho registra a posição continuamente, o que representa a locomoção automatizada por meio do cálculo dos cruzamentos de feixes para estudar a atividade e o ritmo circadiano das moscas em um período maior de tempo15. Embora esses métodos tenham sido amplamente utilizados na análise de defeitos comportamentais em moscas-das-frutas para determinar mudanças na locomoção comportamental, eles sempre requerem equipamentos especiais de teste ou processos complexos de análise, e restringem sua aplicação em alguns modelos com um dispositivo limitado e simples. Estratégias baseadas em grupos de rastreamento animal para testar a Drosophila adulta, como o FlyGrAM11 e o ensaio da ilha de Drosophila 10, implementam o recrutamento social e o rastreamento individual em uma área predefinida. No entanto, a restrição social individual em áreas desafiadas pode ter um efeito negativo sobre as identificações nas imagens, causadas pela colisão ou sobreposição de moscas. Mesmo que alguns métodos baseados em materiais de código aberto, como TRex16, MARGO 12 e FlyPi17, tenham uma emergência, eles podem rastrear rapidamente as moscas com uso flexível em testes comportamentais. Essas abordagens de teste estão associadas a elaboradas instalações de aparelhos experimentais, requisitos especiais de software ou linguagens de computador profissionais. Para as larvas, a mensuração da distância total percorrida ao longo do número de linhas de borda da grade por unidade de tempo18, ou a contagem aproximada das contrações da parede corporal para os indivíduos manualmente19, são os métodos predominantes para avaliar sua capacidade locomotora. Devido à falta de precisão nos equipamentos ou dispositivos e métodos de análise, algumas locomoções comportamentais das larvas podem escapar à detecção, dificultando a avaliação precisa do movimento comportamental, especialmente o movimentofino15.

O presente método desenvolvido utiliza a interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens Fiji (ImageJ), para avaliar sistematicamente a atividade locomotora de moscas adultas e larvais, analisando seu comportamento de rastreamento a partir de vídeos de alta definição (HD). Fiji é um software de código aberto ImageJ distribuição que pode combinar bibliotecas de software robustas com inúmeras linguagens de script, resultando em prototipagem rápida de algoritmos de processamento de imagem, tornando-o popular entre os biólogos por suas capacidades de análise de imagem20. Na abordagem atual, a integração de Fiji na API AnimalTracker é explorada para desenvolver um ensaio comportamental exclusivo de Drosophila com inserção de algoritmo personalizado, e fornece uma etapa útil para documentação detalhada e tutoriais para apoiar capacidades analíticas robustas do comportamento locomotor (Figura 1). Para contornar a complicação de identificações objetivas nas imagens causadas pela colisão ou sobreposição de moscas, cada arena é restrita a hospedar apenas uma mosca. Ao avaliar a precisão do rastreamento da abordagem, implementou-se o rastreamento e quantificação dos movimentos locomotores de Drosophila que foram administrados com a droga tóxica rotenona, que geralmente é usada para modelos animais da doença de Parkinson, descobrindo o comprometimento da locomoção no tratamento medicamentoso21. Esta metodologia, que emprega software livre e de código aberto, não necessita de instrumentação de alto custo, podendo analisar de forma precisa e reprodutível a locomoção comportamental da Drosophila .

Protocol

Foram utilizadas 1118 moscas adultas W 1118 e larvas de terceiro ínstar para o presente estudo. 1. Preparação experimental NOTA: Uma arena de campo aberto para rastreamento de locomoção de Drosophila é feita com sílica gel incolor e inodora. Misture o reagente A e o reagente B na proporção de 1:10, de acordo com as instruções do fabricante para o kit de sílica (consulte a Tabela de Materiais…

Representative Results

No presente estudo, déficits locomotores em moscas adultas e larvas de terceiro ínstar tratadas com rotenona foram examinados e comparados em sua atividade motora com a de uma mosca controle alimentada com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). Demonstrou-se que o tratamento com rotenona em Drosophila causa perda de neurônios dopaminérgicos no cérebro22 e leva a déficits locomotores significativos23. Como mostrado na Figura 11 e na Figura 1…

Discussion

Projetamos um método, baseado no material de código aberto AnimalTracker API compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, que pode permitir que os pesquisadores avaliem sistematicamente a atividade locomotora rastreando larvas adultas e individuais. O AnimalTracke é uma ferramenta escrita em Java que pode ser facilmente integrada a bancos de dados existentes ou outras ferramentas para facilitar a análise do comportamento de rastreamento de animais projetado por aplicativos<sup cla…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por um fundo de lançamento especial da Universidade Soochow e da Fundação Nacional de Ciência da China (NSFC) (82171414). Agradecemos aos membros do laboratório do Prof. Chunfeng Liu por sua discussão e comentários.

Materials

Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

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Diesen Artikel zitieren
Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

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