Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

Drosophila melanogaster fornece um excelente organismo modelo para investigar funções celulares e moleculares em modelos de doenças neuronais criadas por modificação gênica¹, tratamento medicamentoso² e senescência³. A alta conservação de vias biológicas, propriedades físicas e genes homólogos associados a doenças entre humanos e Drosophila torna a mosca-da-fruta uma mimética ideal desde o nível molecular até o comportamental⁴. Em muitos modelos de doenças, a deficiência comportamental é um índice importante, fornecendo um modelo útil para várias neuropatias humanas ^5,6. Atualmente, a drosófila é utilizada no estudo de múltiplas doenças humanas, do neurodesenvolvimento e de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica7,8. A detecção da habilidade motora dos modelos de doença é crucial para a compreensão do progresso patogênico e pode fornecer uma correlação fenotípica com os mecanismos moleculares subjacentes ao processo da doença.

Recentemente, ferramentas de software disponíveis comercialmente e programas de baixo custo têm sido desenvolvidos para estratégias de detecção locomotora de Drosophila, tais como testes de alto rendimento em moscas agrupadas^9,10 e mensuração da locomoção em tempo real^11,12. Uma dessas abordagens convencionais é a geotáxi negativa interativa rápida (RING), também chamada de ensaio de escalada, que inclui múltiplos canais que permitem conter uma grande população de moscas com o mesmo sexo e idade, reduzindo a variação durante a coleta de dados ^9,13. Outro método de pré-teste para análise do comportamento locomotor é o TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), um dispositivo que utiliza múltiplos feixes para detectar o movimento da atividade das moscas dentro de um tubo de vidro fino¹⁴. O aparelho registra a posição continuamente, o que representa a locomoção automatizada por meio do cálculo dos cruzamentos de feixes para estudar a atividade e o ritmo circadiano das moscas em um período maior de tempo¹⁵. Embora esses métodos tenham sido amplamente utilizados na análise de defeitos comportamentais em moscas-das-frutas para determinar mudanças na locomoção comportamental, eles sempre requerem equipamentos especiais de teste ou processos complexos de análise, e restringem sua aplicação em alguns modelos com um dispositivo limitado e simples. Estratégias baseadas em grupos de rastreamento animal para testar a Drosophila adulta, como o FlyGrAM¹¹ e o ensaio da ilha de Drosophila ¹⁰, implementam o recrutamento social e o rastreamento individual em uma área predefinida. No entanto, a restrição social individual em áreas desafiadas pode ter um efeito negativo sobre as identificações nas imagens, causadas pela colisão ou sobreposição de moscas. Mesmo que alguns métodos baseados em materiais de código aberto, como TRex¹⁶, MARGO 12 e FlyPi¹⁷, tenham uma emergência, eles podem rastrear rapidamente as moscas com uso flexível em testes comportamentais. Essas abordagens de teste estão associadas a elaboradas instalações de aparelhos experimentais, requisitos especiais de software ou linguagens de computador profissionais. Para as larvas, a mensuração da distância total percorrida ao longo do número de linhas de borda da grade por unidade de tempo¹⁸, ou a contagem aproximada das contrações da parede corporal para os indivíduos manualmente¹⁹, são os métodos predominantes para avaliar sua capacidade locomotora. Devido à falta de precisão nos equipamentos ou dispositivos e métodos de análise, algumas locomoções comportamentais das larvas podem escapar à detecção, dificultando a avaliação precisa do movimento comportamental, especialmente o movimento^fino15.

O presente método desenvolvido utiliza a interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens Fiji (ImageJ), para avaliar sistematicamente a atividade locomotora de moscas adultas e larvais, analisando seu comportamento de rastreamento a partir de vídeos de alta definição (HD). Fiji é um software de código aberto ImageJ distribuição que pode combinar bibliotecas de software robustas com inúmeras linguagens de script, resultando em prototipagem rápida de algoritmos de processamento de imagem, tornando-o popular entre os biólogos por suas capacidades de análise de imagem²⁰. Na abordagem atual, a integração de Fiji na API AnimalTracker é explorada para desenvolver um ensaio comportamental exclusivo de Drosophila com inserção de algoritmo personalizado, e fornece uma etapa útil para documentação detalhada e tutoriais para apoiar capacidades analíticas robustas do comportamento locomotor (Figura 1). Para contornar a complicação de identificações objetivas nas imagens causadas pela colisão ou sobreposição de moscas, cada arena é restrita a hospedar apenas uma mosca. Ao avaliar a precisão do rastreamento da abordagem, implementou-se o rastreamento e quantificação dos movimentos locomotores de Drosophila que foram administrados com a droga tóxica rotenona, que geralmente é usada para modelos animais da doença de Parkinson, descobrindo o comprometimento da locomoção no tratamento medicamentoso²¹. Esta metodologia, que emprega software livre e de código aberto, não necessita de instrumentação de alto custo, podendo analisar de forma precisa e reprodutível a locomoção comportamental da Drosophila .