Summary

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.

Abstract

Drosophila melanogaster is een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van verschillende ziekten vanwege de overvloed aan geavanceerde genetische manipulatietechnieken en diverse gedragskenmerken. Het identificeren van gedragsdeficiëntie in diermodellen is een cruciale maat voor de ernst van de ziekte, bijvoorbeeld bij neurodegeneratieve ziekten waarbij patiënten vaak stoornissen in de motorische functie ervaren. Met de beschikbaarheid van verschillende systemen om motorische tekorten in vliegmodellen te volgen en te beoordelen, zoals met geneesmiddelen behandelde of transgene personen, ontbreekt het echter nog steeds aan een economisch en gebruiksvriendelijk systeem voor nauwkeurige evaluatie vanuit meerdere hoeken. Een methode op basis van de AnimalTracker application programming interface (API) is hier ontwikkeld, die compatibel is met het Fiji-beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de bewegingsactiviteiten van zowel volwassen als larvale individuen van opgenomen video te evalueren, waardoor de analyse van hun trackinggedrag mogelijk is. Deze methode vereist alleen een high-definition camera en een computerrandapparatuurintegratie om gedrag vast te leggen en te analyseren, waardoor het een betaalbare en effectieve aanpak is voor het screenen van vliegmodellen met transgene of omgevingsgedragsgebreken. Voorbeelden van gedragstests met farmacologisch behandelde vliegen worden gegeven om te laten zien hoe de technieken gedragsveranderingen bij zowel volwassen vliegen als larven op een zeer herhaalbare manier kunnen detecteren.

Introduction

Drosophila melanogaster biedt een uitstekend modelorganisme voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire functies in neuronale ziektemodellen gemaakt door genmodificatie1, medicamenteuze behandeling2 en senescentie3. Het hoge behoud van biologische routes, fysieke eigenschappen en ziekte-geassocieerde homologe genen tussen mensen en Drosophila maakt de fruitvlieg een ideale nabootsing van het moleculaire naar het gedragsniveau4. In veel ziektemodellen is gedragsdeficiëntie een belangrijke index, die een nuttig model biedt voor verschillende menselijke neuropathieën 5,6. Drosophila wordt nu gebruikt om meerdere menselijke ziekten, neurologische ontwikkeling en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en amyotrofische laterale sclerose te bestuderen 7,8. Het detecteren van het motorisch vermogen van de ziektemodellen is cruciaal voor het begrijpen van de pathogene vooruitgang en kan een fenotypische correlatie bieden met de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het ziekteproces.

Onlangs zijn commercieel beschikbare softwaretools en kosteneffectieve programma’s ontwikkeld voor Drosophila locomotorische detectiestrategieën, zoals high-throughput testen in gegroepeerde vliegen 9,10 en het meten van voortbeweging in real-time11,12. Een dergelijke conventionele benadering is snelle interactieve negatieve geotaxis (RING), ook wel de klimtest genoemd, die meerdere kanalen omvat waarmee een grote vliegenpopulatie met hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd kan worden ingeperkt, waardoor variatie wordt verminderd terwijl gegevens 9,13 worden verzameld. Een andere pre-testmethode voor het analyseren van locomotorisch gedrag is TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), een apparaat dat meerdere bundels gebruikt om vliegactiviteitsbewegingen in een dunne glazen buiste detecteren 14. Het apparaat registreert continu de positie, wat de geautomatiseerde voortbeweging vertegenwoordigt door de balkkruisingen te berekenen om de activiteit en het circadiane ritme van vliegen over een langere periode te bestuderen15. Hoewel deze methoden op grote schaal zijn gebruikt bij het analyseren van gedragsdefecten bij fruitvliegen om veranderingen in gedragsvoortbeweging te bepalen, vereisen ze altijd speciale testapparatuur of complexe analyseprocessen en beperken ze hun toepassing in sommige modellen met een beperkt, eenvoudig apparaat. Diertraceringsgroepgebaseerde strategieën voor het testen van de volwassen Drosophila, zoals FlyGrAM11 en de Drosophila-eilandtest 10, implementeren sociale rekrutering en individuele tracking in een vooraf gedefinieerd gebied. Niettemin kan sociale individuele beperking in getrotseerde gebieden een negatief effect hebben op identificaties in de beelden, veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen. Hoewel sommige op open-source materialen gebaseerde methoden, zoals TRex16, MARGO 12 en FlyPi17, een noodgeval hebben, kunnen ze de vliegen snel traceren met flexibel gebruik in gedragstests. Deze testbenaderingen worden geassocieerd met uitgebreide experimentele apparaatinstallaties, speciale softwarevereisten of professionele computertalen. Voor larven zijn het meten van de totale afgelegde afstand over het aantal rastergrenslijnen per tijdseenheid18, of het ruw tellen van de lichaamswandcontracties voor individuen handmatig19, de belangrijkste methoden om hun motorische vermogen te beoordelen. Vanwege het gebrek aan precisie in apparatuur of apparaten en analysemethoden, kan enige gedragsbeweging van larven aan detectie ontsnappen, waardoor het moeilijk wordt om gedragsbewegingen nauwkeurig te beoordelen, vooral fijne beweging15.

De huidige ontwikkelde methode maakt gebruik van de AnimalTracker application programming interface (API), compatibel met het Fiji (ImageJ) beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de locomotorische activiteit van zowel volwassen als larvale vliegen te evalueren door hun trackinggedrag van high-definition (HD) video’s te analyseren. Fiji is een open-source software ImageJ-distributie die robuuste softwarebibliotheken kan combineren met tal van scripttalen, wat resulteert in snelle prototyping van beeldverwerkingsalgoritmen, waardoor het populair is bij biologen vanwege de beeldanalysemogelijkheden20. In de huidige aanpak wordt de integratie van Fiji in de AnimalTracker API gebruikt om een unieke Drosophila-gedragstest te ontwikkelen met gepersonaliseerde algoritme-invoeging, en biedt een nuttige stap voor gedetailleerde documentatie en tutorials ter ondersteuning van robuuste analytische mogelijkheden van locomotorisch gedrag (figuur 1). Om de complicatie van objectieve identificaties in de beelden veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen te omzeilen, is elke arena beperkt tot het hosten van slechts één vlieg. Na het beoordelen van de trackingprecisie van de aanpak, werd het geïmplementeerd om de locomotorische bewegingen van Drosophila te traceren en te kwantificeren die werden toegediend met het toxische medicijn rotenon, dat over het algemeen wordt gebruikt voor diermodellen van de ziekte van Parkinson, en uiteindelijk locomotiestoornissen ontdekte in de medicamenteuze behandeling21. Deze methodologie, die open-source en vrije software gebruikt, vereist geen dure instrumentatie en kan de gedragsbeweging van Drosophila nauwkeurig en reproduceerbaar analyseren.

Protocol

W1118 volwassen vliegen en derde instar larven werden gebruikt voor de huidige studie. 1. Experimentele voorbereiding OPMERKING: Een open-veld arena voor Drosophila locomotion tracking is gemaakt metacolorless en geurloze silicagel. Meng reagens A en reagens B in een verhouding van 1:10, volgens de instructies van de fabrikant voor de silicakit (zie materiaaltabel). Zorg ervoor dat natriumbicar…

Representative Results

In deze studie werden locomotorische tekorten bij volwassen vliegen en derde instarlarven behandeld met rotenon onderzocht en vergeleken in hun motorische activiteit met die van een controlevlieg gevoed met het geneesmiddel oplosmiddel dimethylsulfoxide (DMSO). Van behandeling met rotenon in Drosophila is aangetoond dat het dopaminerge neuronverlies in de hersenenveroorzaakt 22 en leidt tot significante locomotorische tekorten23. Zoals te zien is in figuur <strong …

Discussion

We hebben een methode ontworpen, gebaseerd op het open-source materiaal AnimalTracker API compatibel met het Fiji-beeldverwerkingsprogramma, waarmee onderzoekers systematisch locomotorische activiteit kunnen evalueren door zowel volwassen als individuele larvale vliegen te volgen. AnimalTracke is een tool geschreven in Java die eenvoudig kan worden geïntegreerd in bestaande databases of andere tools om de analyse van door de toepassing ontworpen gedrag van het volgen van dieren te vergemakkelijken<sup …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een speciaal lanceringsfonds van Soochow University en de National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). We bedanken prof. Chunfeng Liu’s lableden voor hun discussie en commentaar.

Materials

Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

Referenzen

  1. Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson’s disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
  2. Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
  3. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
  4. Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
  5. Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
  6. Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer’s disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
  7. Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson’s disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
  8. Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
  9. Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
  10. Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
  11. Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
  12. Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
  13. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  14. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
  15. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
  16. Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
  17. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  19. Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson’s disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
  22. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
  23. Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
  24. Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
  25. Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
  26. Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

View Video