Summary

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Published: March 10, 2023
doi:

Summary

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell’epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Abstract

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una malattia debilitante della retina nelle popolazioni che invecchiano. È opinione diffusa che la disfunzione dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico chiave nell’AMD. Per comprendere i meccanismi che portano alla disfunzione RPE, i modelli murini possono essere utilizzati dai ricercatori. È stato stabilito da studi precedenti che i topi possono sviluppare patologie RPE, alcune delle quali sono osservate negli occhi di individui con diagnosi di AMD. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE nei topi. Questo protocollo include la preparazione e la valutazione delle sezioni trasversali retiniche mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, nonché quella dei supporti piani RPE mediante microscopia confocale. Descriviamo in dettaglio i tipi comuni di patologie RPE murine osservate da queste tecniche e i modi per quantificarle attraverso metodi imparziali per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo questo protocollo di fenotipizzazione RPE per quantificare le patologie RPE osservate nei topi che sovraesprimono la proteina transmembrana 135 (Tmem135) e nei topi C57BL/6J wild-type invecchiati. L’obiettivo principale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini di AMD.

Introduction

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una malattia accecante comune che colpisce le popolazioni di età superiore ai 55anni 1. Molti ricercatori ritengono che la disfunzione all’interno dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico precoce e cruciale nell’AMD2. L’RPE è un monostrato di cellule polarizzate che ha il compito di mantenere l’omeostasi dei fotorecettori vicini e dei vasi sanguigni coroideali3. Esistono vari modelli per studiare i meccanismi associati alla malattia all’interno dell’RPE, compresi i modelli di coltura cellulare 4,5 e topi 6,7,8. Un recente rapporto ha descritto protocolli standardizzati e criteri di controllo della qualità per i modelli di coltura cellulare RPE4, ma nessun rapporto ha tentato di standardizzare la fenotipizzazione dell’RPE nei modelli murini. In effetti, molte pubblicazioni su modelli murini di AMD mancano di una descrizione completa dell’RPE o della quantificazione delle patologie RPE in essi. L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini AMD.

Pubblicazioni precedenti hanno notato la presenza di diverse patologie RPE nei topi attraverso tre tecniche di imaging. Ad esempio, la microscopia ottica consente ai ricercatori di visualizzare la morfologia grossolana della retina murina (Figura 1A) e rilevare patologie RPE come assottigliamento RPE, vacuolizzazione e migrazione. L’assottigliamento dell’RPE in un modello di mouse AMD è esemplificato da una deviazione nell’altezza dell’RPE dai rispettivi controlli (Figura 1B). La vacuolizzazione RPE può essere suddivisa in due categorie separate: microvacuolizzazione (Figura 1C) e macrovacuolizzazione (Figura 1D). La microvacuolizzazione RPE è riassunta dalla presenza di vacuoli nell’RPE che non influiscono sulla sua altezza complessiva, mentre la macrovacuolizzazione è indicata dalla presenza di vacuoli che sporgono nei segmenti esterni dei fotorecettori. La migrazione RPE si distingue per l’aggregato focale di pigmento sopra il monostrato RPE in una sezione trasversale retinica (Figura 1E). Va notato che le cellule RPE migratorie negli occhi dei donatori di AMD mostrano immunoreattività ai marcatori delle cellule immunitarie, come il cluster di differenziazione 68 (CD68)9, e potrebbero rappresentare cellule immunitarie che inghiottono detriti RPE o RPE in fase di transdifferenziazione 9. Un’altra tecnica di imaging chiamata microscopia elettronica a trasmissione può consentire ai ricercatori di visualizzare l’ultrastruttura dell’RPE e la sua membrana basale (Figura 2A). Questa tecnica può identificare il deposito sub-RPE predominante nei topi, noto come deposito laminare basale (BLamD) (Figura 2B)10. Infine, la microscopia confocale può rivelare la struttura delle cellule RPE attraverso l’imaging di supporti piatti RPE (Figura 3A). Questo metodo può scoprire la dismorfia RPE, la deviazione dell’RPE dalla sua classica forma a nido d’ape (Figura 3B). Può anche rilevare la multinucleazione RPE, la presenza di tre o più nuclei all’interno di una cellula RPE (Figura 3C). Per una sintesi dei tipi di patologie RPE presenti negli attuali modelli murini AMD, rimandiamo i ricercatori a queste recensioni dalla letteratura 6,7.

I ricercatori che studiano l’AMD dovrebbero essere consapevoli dei vantaggi e degli svantaggi dell’uso dei topi per studiare le patologie RPE prima del protocollo di fenotipizzazione. I topi sono vantaggiosi a causa della loro durata di vita relativamente breve e del rapporto costo-efficacia, nonché della loro manipolabilità genetica e farmacologica. I topi mostrano anche cambiamenti degenerativi RPE, tra cui migrazione RPE, dismorfia e multinucleazione, che si osservano negli occhi dei donatori di AMD 11,12,13,14,15,16,17; ciò suggerisce che meccanismi simili possono essere alla base dello sviluppo di queste patologie RPE nei topi e negli esseri umani. Tuttavia, ci sono differenze chiave che limitano la traducibilità degli studi sui topi all’AMD umana. In primo luogo, i topi non hanno una macula, una regione anatomicamente distinta della retina umana necessaria per l’acuità visiva che è preferenzialmente influenzata nell’AMD. In secondo luogo, alcune patologie RPE nei topi, come l’assottigliamento e la vacuolizzazione dell’RPE, non sono tipicamente osservate negli occhi dei donatori di AMD18. In terzo luogo, i topi non sviluppano drusen, un segno distintivo della patologia AMD19. Le drusen sono depositi contenenti lipidi e proteine con pochissime proteine di membrana basale che si formano tra la lamina basale RPE e lo strato collagenoso interno della membrana di Bruch (BrM)19. Drusen differisce da BLamD, il comune deposito sub-RPE nei topi, sia nella loro composizione che nella posizione anatomica. Le BLamD sono anomalie arricchite dalla matrice extracellulare dipendenti dall’età e dallo stress che si formano tra la lamina basale RPE di BrM e le pieghe basali dell’RPE20. È interessante notare che i BLamD hanno una composizione proteica e un aspetto simili sia nei topi che negli esseri umani 6,10,21. Lavori recenti suggeriscono che i BLamD possono agire nella patobiologia dell’AMD influenzando la progressione dell’AMD fino alle sue fasi successive18,22; pertanto, questi depositi possono rappresentare RPE malato nella retina del topo. La conoscenza di questi benefici e limitazioni è fondamentale per i ricercatori interessati a tradurre i risultati degli studi sui topi in AMD.

In questo protocollo, discutiamo i metodi per preparare gli occhi alla luce, alla trasmissione elettronica e alla microscopia confocale per visualizzare le patologie RPE. Descriviamo anche come quantificare le patologie RPE in modo imparziale per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo il protocollo di fenotipizzazione RPE per studiare le patologie strutturali RPE osservate nei topi sovraesprimenti della proteina transmembrana 135- (Tmem135) e nei topi C57BL / 6J wild-type (WT) invecchiati. In sintesi, ci proponiamo di descrivere la metodologia di fenotipizzazione per caratterizzare l’RPE nei modelli murini AMD, poiché attualmente non sono disponibili protocolli standard. I ricercatori interessati a esaminare e quantificare le patologie dei fotorecettori o della coroide, che sono anche interessati nei modelli murini AMD, potrebbero non trovare questo protocollo utile per i loro studi.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee presso l’Università del Wisconsin-Madison e sono in aderenza con la dichiarazione dell’Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l’uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. 1. Valutazione dell’RPE del mouse mediante microscopia ottica Fare un tampone fissativo che abbia una concentrazione finale del 2% di paraformald…

Representative Results

Il completamento del protocollo di fenotipizzazione RPE descritto in questo articolo fornisce un’analisi quantitativa delle anomalie strutturali di RPE comunemente osservate nei modelli murini di AMD. Per confermare l’efficacia di questo protocollo, lo abbiamo usato in topi noti per mostrare patologie RPE, inclusi topi transgenici che sovraesprimono WT Tmem135 guidato dal promotore della beta-actina di pollo (Tmem135 TG) 30 e topi C57BL / 6J invecchiati 31,32<sup class…

Discussion

In questo articolo, abbiamo introdotto un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE strutturali dei modelli murini. Abbiamo descritto i passaggi necessari per l’elaborazione degli occhi per varie tecniche di imaging tra cui luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale, nonché la quantificazione delle patologie tipiche osservate tramite questi metodi di imaging. Abbiamo dimostrato l’efficacia del nostro protocollo di fenotipizzazione RPE esaminando Tmem135 TG e topi WT di 2…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Satoshi Kinoshita e il laboratorio TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) dell’Università del Wisconsin (UW) per aver preparato i nostri tessuti per la microscopia ottica. Questo nucleo è supportato dal Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio della UW, dal Carbone Cancer Center dell’Università del Wisconsin (P30 CA014520) e dall’Ufficio del Direttore-NIH (S10OD023526). La microscopia confocale è stata eseguita presso il nucleo ottico di biochimica UW, che è stato istituito con il supporto del Dipartimento di Biochimica della UW. Questo lavoro è stato sostenuto anche da sovvenzioni del National Eye Institute (R01EY022086 a A. Ikeda; R01EY031748 a C. Bowes Rickman; P30EY016665 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive della UW; P30EY005722 al Duke Eye Center; NIH T32EY027721 a M. Landowski; F32EY032766 a M. Landowski), Presidenza di Timothy William Trout (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); e una sovvenzione illimitata dalla Ricerca per prevenire la cecità (Duke Eye Center).

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

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Diesen Artikel zitieren
Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

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