교모세포종에 대한 면역요법 전략으로서의 진균성 β-글루칸의 분리 및 정제
Summary
본 프로토콜은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 항종양 특성을 향상시키는 잠재적인 면역 조절 분자로서 4가지 다른 진균 β글루칸의 정제 단계 및 후속 연구를 설명합니다.
Abstract
교모세포종에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 있어 가장 큰 과제 중 하나는 종양 미세 환경 내에서 강력한 면역 억제를 극복하는 것입니다. 면역 요법은 종양 세포에 대한 면역계 반응을 돌리는 효과적인 전략으로 부상했습니다. 신경아교종 관련 대식세포 및 미세아교세포(GAM)는 이러한 항염증 시나리오의 주요 동인입니다. 따라서 GAM에서 항암 반응을 향상시키는 것은 교모세포종 환자를 치료하기 위한 잠재적인 공동 보조 요법을 나타낼 수 있습니다. 그런 맥락에서 곰팡이 β글루칸 분자는 오랫동안 강력한 면역 조절제로 알려져 왔습니다. 선천성 면역 활동을 자극하고 치료 반응을 개선하는 능력이 설명되었습니다. 이러한 조절 기능은 부분적으로 패턴 인식 수용체에 결합하는 능력에 기인하며, 흥미롭게도 GAM에서 크게 표현됩니다. 따라서 이 작업은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 종양 반응을 향상시키기 위한 진균 β글루칸의 분리, 정제 및 후속 사용에 중점을 둡니다. 마우스 교모세포종(GL261) 및 미세아교세포(BV-2) 세포주는 현재 바이오 제약 산업에서 많이 사용되는 버섯에서 추출한 4가지 다른 진균 β글루칸(Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum)의 면역 조절 특성을 테스트하는 데 사용됩니다. 이들 화합물을 시험하기 위해, 교모세포종 세포에서의 증식 및 세포자멸사 활성화에 대한 사전 활성화된 미세아교세포-조건화 배지의 효과를 측정하기 위해 공동-자극 분석을 수행하였다.
Introduction
신경 종양학 분야에서 새로운 업적이 출현 했음에도 불구하고 교 모세포종 환자의 기대 수명은 여전히 미미합니다. 뇌종양에 대한 표준 치료법은 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 융합을 기반으로 합니다. 그러나 지난 10년 동안 면역요법은 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 강력한 전략으로 부상했다1. 따라서 종양 세포에 대한 신체의 면역 반응을 활용할 수 있는 가능성은 최근 종양학의 네 번째 기둥이 되었습니다.
이 분야에서 가장 큰 과제 중 하나는 종양미세환경2에서 발견되는 강력한 면역억제를 극복하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 특히, 가장 흔하고 공격적인 형태의 뇌암 중 하나인 교모세포종의 경우, 이러한 종양 전(前)종양 시나리오를 조율하는 주요 경로를 밝히고 면역 체계의 우울한 반응을 상쇄할 수 있는 새로운 화합물을 찾는 것은 이 난치병에 대한 미래 치료법의 길을 열 수 있습니다.
뇌는 자체 면역 체계 세포를 가지고 있으며 가장 관련성이 높은 세포 유형은 미세 아교 세포입니다. 이 세포들은 서로 다른 중추 질환에 걸쳐 다소 복잡한 행동을 하는 것으로 입증되었다3. 원발성 뇌종양(예: 교모세포종)의 경우, 이들 세포는 종양 세포가 뇌 실질에 서식하도록 지원하는 항염증 표현형으로 이동한다3. 수많은 출판물이 종양 진행 동안 이러한 세포의 주요 역할을 향상시켰습니다. 그 주된 이유 중 하나는 신경교종 관련 미세아교세포와 침윤성 대식세포(GAM)가 전체 종양 질량의 1/3을 차지하기 때문에 뇌종양 진행 중 활성화 상태의 명백한 영향을 시사하기 때문입니다 4,5.
이러한 맥락에서 진균 β-글루칸은 식균 작용 및 전염증 인자 생성을 포함한 효과적인 면역 반응을 유발하는 강력한 분자로 설명되어 악성 물질인 6,7,8,9,10을 제거합니다. 곰팡이 β글루칸은 일반적으로 다른 버섯 부분의 추출물을 사용하여 연구되었습니다. 그러나, 특정 효과의 귀속은 모호성을 피하고 면역조절제8와 같은 분자의 작용 기전을 이해할 수 있도록 정제를 필요로 한다.
이 연구에서 용해성 β 글루칸은 식용 버섯 (Pleurotus ostreatus 및 Pleurotus djamor) 및 약용 버섯 (Ganoderma lucidum 및 Hericium erinaceus)으로 정기적으로 사용되는 4 가지 버섯의 자실체에서 정제됩니다. 특히, 이 4가지 버섯은 식품 및 제약 산업에서 많이 사용되며 상업 기업의 환경 친화적인 순환 경제 내에서 생산되었습니다( 재료 표 참조).
뇌암 치료에서 진균 β글루칸의 향후 사용을 위한 토대를 마련하기 위해서는 항종양 매개체로서의 잠재적 역할을 평가하기 위해 잘 정의된 정제 전략과 면역계 세포와의 추정 상호 작용을 탐구하는 전임상 연구가 필수적입니다. 이 작업은 선택된 버섯의 자실체 내에 포함된 용해성 β글루칸을 회수하는 데 필요한 수많은 분리 및 정제 단계를 설명합니다. 성공적으로 정제되면 미세아교세포가 활성화되어 염증 표현형이 향상됩니다. 마우스 교모세포종 세포(GL261)를 이전에 이러한 추출물로 처리한 다른 미세아교세포 조절 배지로 코팅한 다음 종양 세포의 행동에 미치는 영향을 평가합니다. 흥미롭게도, 우리 연구실의 파일럿 연구 (데이터는 표시되지 않음)는 전 염증성 미세 아교 세포가 교 모세포종 세포뿐만 아니라 다른 암 세포주에서도 종양 세포 이동 및 침윤 특성을 늦출 수있는 방법을 밝혀 냈습니다. 이 다학제적 연구는 종양학 연구자들이 다양한 유형의 종양에서 면역 반응을 높일 수 있는 유망한 화합물을 테스트하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 4가지 다른 균류에서 SβG의 함량을 성공적으로 분리, 정제 및 특성화하기 위해 잘 확립된 기술의 사용을 설명합니다. 그 결과, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, H. erinaceus로부터 얻은 SMP를 열수 추출한 후 α-아밀라아제, 글루코시다아제, 프로테아제로 가수분해 처리한 후 α-글루칸과 단백질의 함량이 감소하여 순수한 SβG의 양이 크게 풍부해졌습니다.
<p class="jove_…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ImageJ에서 fuluorescence 신호를 측정하기 위한 사내 스크립트를 제공한 Vasiliki Economopoulos 박사에게 감사드립니다. 또한 시위 기간 동안 지원해 주신 CITIUS(세비야 대학교)와 모든 직원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 스페인 FEDER I + D + i-USE의 지원을 받았으며 세비야 대학의 US-1264152 및 Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00의 지원을 받았습니다.
Materials
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
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