Summary

Imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare utilizzando il calcofluor nel muschio Physcomitrium patens

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per visualizzare le dinamiche della parete cellulare 3D del tessuto di muschio vivente, consentendo la visualizzazione del distacco delle pareti cellulari nei mutanti ggb e l’ispessimento dei modelli di parete cellulare nel tipo selvatico durante lo sviluppo per un lungo periodo.

Abstract

L’imaging time-lapse con microscopia a fluorescenza consente l’osservazione dei cambiamenti dinamici di crescita e sviluppo a livello cellulare e subcellulare. In generale, per osservazioni su un lungo periodo, la tecnica richiede la trasformazione di una proteina fluorescente; Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, la trasformazione genetica richiede tempo o tecnicamente non è disponibile. Questo manoscritto presenta un protocollo per l’imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare per un periodo di 3 giorni utilizzando colorante calcofluor (che colora la cellulosa nella parete cellulare della pianta), sviluppato nel muschio Physcomitrium patens. Il segnale del colorante calcofluor dalla parete cellulare è stabile e può durare per 1 settimana senza evidente decadimento. Utilizzando questo metodo, è stato dimostrato che il distacco delle cellule nei mutanti ggb (in cui la subunità beta della proteina geranilgeraniltransferasi-I viene eliminata) è causato dall’espansione cellulare non regolata e da difetti di integrità della parete cellulare. Inoltre, i modelli di colorazione del calcofluor cambiano nel tempo; Le regioni meno intensamente colorate sono correlate con i futuri siti di espansione/ramificazione cellulare nel tipo selvatico. Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.

Introduction

Le pareti cellulari delle piante subiscono cambiamenti dinamici durante l’espansione e lo sviluppo cellulare 1,2,3. Il mantenimento dell’integrità della parete cellulare è fondamentale per l’adesione delle cellule vegetali durante la crescita e lo sviluppo, nonché per la risposta ai segnali ambientali. Sebbene visualizzare le dinamiche della parete cellulare delle cellule viventi per un lungo periodo di tempo sia fondamentale per capire come viene mantenuta l’adesione cellulare durante lo sviluppo e l’adattamento ai cambiamenti ambientali, i metodi attuali per osservare direttamente le dinamiche della parete cellulare sono ancora impegnativi.

L’imaging time-lapse dei cambiamenti cellulari può fornire dinamiche di sviluppo informative di un organismo utilizzando un microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione 4,5,6,7. Mentre l’imaging 3D time-lapse ha un grande potenziale per studiare i cambiamenti dinamici della forma cellulare durante la crescita e lo sviluppo, la tecnica normalmente richiede la trasformazione di una proteina fluorescente 4,5,6,7. Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, le trasformazioni genetiche richiedono tempo o sono tecnicamente impegnative. In alternativa, i coloranti fluorescenti che si attaccano ai componenti cellulari sono disponibili da tempo. I coloranti fluorescenti possono emettere luce fluorescente dopo l’irradiazione con luce di una certa lunghezza d’onda. Esempi comuni sono Edu, DAPI, PI, FM4-64 e calcofluor white 8,9,10. Uno dei principali svantaggi, tuttavia, è che questi coloranti possono essere tipicamente utilizzati solo in tessuti fissi o per brevi esperimenti, in parte a causa del danno che causano alla cellula 8,9,10.

Con il protocollo presentato qui, i segnali calcofluor sono stabili quando il bianco calcofluor viene miscelato all’interno del mezzo durante gli esperimenti time-lapse nel muschio P. patens. Utilizzando questo metodo, il distacco delle cellule nei mutanti ggb utilizzando l’imaging time-lapse 3D è stato osservato in un periodo di 3 giorni3 (Figura 1). Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.

Protocol

NOTA: vedere la Tabella dei materiali per l’elenco dei materiali e delle apparecchiature e la Tabella 1 per l’elenco delle soluzioni da utilizzare in questo protocollo. 1. Preparazione di piante per piatti con fondo di vetro Coltivare il tessuto protonemico di muschio in mezzo di agar BCDAT in una capsula di Petri di 13 cm sotto luce bianca costante (~50 μmol m-2 s-1) per 7 giorni a 25 °C nella camera di crescita.</…

Representative Results

Questo metodo consente l’osservazione della dinamica della parete cellulare durante lo sviluppo in mutanti wild type e ggb (Figura 1). I risultati hanno mostrato che le regioni con meno ispessimento della parete cellulare sono correlate con i siti di espansione / ramificazione cellulare, consentendo la previsione di siti di espansione / ramificazione nel tipo selvatico (Figura 1A). La superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb è stata l…

Discussion

La ricostruzione 3D time-lapse, o imaging 4-D, è un potente strumento per osservare le dinamiche della morfologia cellulare durante i processi di sviluppo. In questo protocollo, mescolando il bianco calcofluor nel mezzo, la dinamica della morfologia cellulare 3D può essere osservata nel muschio P. patens. Usando questo metodo, abbiamo osservato che la superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb viene fatta a pezzi durante lo sviluppo3. Inoltre, il ridotto ispessimento del…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano la dottoressa Soucy Patricia e Betty Nunn dell’Università di Louisville per l’assistenza con il microscopio confocale. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (1456884 to M.P.R.) e da un National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 to M.P.R.).

Materials

3-mm-thick red plastic light filter  Mitsubishi  no.102
27 mm diameter glass base dish  Iwaki 3930-035
Agar  Sigma A6924
Calcofluor white   Sigma 18909-100ML-F Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope  Nikon  A1

NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Fluorescence microscope  Nikon  TE200  Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum  Nacali Tesque 12389-96
Plant Growth Chambers SANYO  Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter Millipore SLGV033RS

Referenzen

  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Bao, L., Running, M. P. 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens. J. Vis. Exp. (192), e64651, doi:10.3791/64651 (2023).

View Video