Summary

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

Abstract

הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. באופן כללי, עבור תצפיות על פני תקופה ארוכה, הטכניקה דורשת טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי; עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציה גנטית גוזלת זמן או אינה זמינה מבחינה טכנית. כתב יד זה מציג פרוטוקול להדמיית קיטוע זמן תלת-ממדי של דינמיקת דופן התא במשך 3 ימים באמצעות צבע קלקופלור (המכתים תאית בדופן תא הצמח), שפותח בפטנס פיסקומיטריום טחב. אות צבע הקלקופלור מדופן התא יציב ויכול להימשך שבוע ללא ריקבון ברור. באמצעות שיטה זו, הוכח כי ניתוק התאים במוטציות ggb (שבו תת-היחידה בטא geranylgeranyltransferase-I הוא דפק החוצה) נגרמת על ידי התרחבות תאים בלתי מבוקרת פגמים שלמות דופן התא. יתר על כן, דפוסי צביעת calcofluor להשתנות עם הזמן; אזורים מוכתמים פחות בעוצמה מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות העתידיים של התאים בסוג הבר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

Introduction

דפנות תאי הצמח עוברות שינויים דינמיים במהלך התרחבות התאים והתפתחותם 1,2,3. שמירה על שלמות דופן התא היא קריטית להידבקות תאי צמח במהלך גדילה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. למרות שהדמיית דינמיקה של דופן התא של תאים חיים לאורך תקופת זמן ארוכה היא קריטית להבנת האופן שבו הידבקות התא נשמרת במהלך הפיתוח והסתגלות לשינויים סביבתיים, השיטות הנוכחיות לצפייה ישירה בדינמיקה של דופן התא עדיין מאתגרות.

הדמיה בהילוך מהיר של שינויים תאיים יכולה לספק דינמיקה התפתחותית אינפורמטיבית של אורגניזם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה 4,5,6,7. בעוד שהדמיית תלת-ממד בהילוך מהיר היא בעלת פוטנציאל רב לחקר שינויים דינמיים בצורת התא במהלך גדילה והתפתחות, הטכניקה דורשת בדרך כלל טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי 4,5,6,7. עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציות גנטיות גוזלות זמן רב או מאתגרות מבחינה טכנית. כחלופה, צבעים פלואורסצנטיים המתחברים לרכיבים תאיים זמינים זה מכבר. הצבעים הפלואורסצנטיים יכולים לפלוט אור פלואורסצנטי לאחר הקרנה עם אור באורך גל מסוים. דוגמאות נפוצות הן Edu, DAPI, PI, FM4-64 ו- calcofluor לבן 8,9,10. חיסרון עיקרי אחד, עם זאת, הוא שצבעים אלה יכולים לשמש בדרך כלל רק ברקמות קבועות או לניסויים קצרים, בין השאר בשל הנזק שהם גורמים לתא 8,9,10.

עם הפרוטוקול המוצג כאן, אותות calcofluor יציבים כאשר calcofluor לבן מעורבב בתוך התווך במהלך ניסויים time-lapse ב טחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ניתוק תאים במוטציות ggb באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר נצפהבמשך תקופה של 3 ימים 3 (איור 1). שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים והציוד ובטבלה 1 לקבלת רשימת הפתרונות שישמשו בפרוטוקול זה. 1. הכנת צמחים לכלים תחתונים מזכוכית לגדל את הרקמה פרוטונמלית טחב בתווך אגר BCDAT בצלחת פטרי 13 ס”מ תחת אור לבן קבוע (~ 50 μmol m-2 s-1) במשך 7 ימי?…

Representative Results

שיטה זו מאפשרת תצפית על דינמיקה של דופן התא במהלך ההתפתחות במוטנטים מסוג בר ומוטציות ggb (איור 1). התוצאות הראו שאזורים עם פחות עיבוי של דופן התא מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא, מה שמאפשר חיזוי של אתרי התפשטות/הסתעפות בסוג הבר (איור 1A). פני השטח של …

Discussion

שחזור תלת-ממדי בהילוך מהיר, או הדמיה 4-D, הוא כלי רב עוצמה לצפייה בדינמיקה של המורפולוגיה התאית במהלך תהליכים התפתחותיים. בפרוטוקול זה, על ידי ערבוב הקלקופלור הלבן בתווך, ניתן לראות את הדינמיקה של המורפולוגיה התאית התלת-ממדית בטחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ראינו כי פני השטח של דפנות התא במ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר סוסי פטרישיה ובטי נון מאוניברסיטת לואיוויל על הסיוע במיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1456884 ל- M.P.R.) ועל ידי הסכם שיתוף פעולה של הקרן הלאומית למדע (1849213 ל- M.P.R).

Materials

3-mm-thick red plastic light filter  Mitsubishi  no.102
27 mm diameter glass base dish  Iwaki 3930-035
Agar  Sigma A6924
Calcofluor white   Sigma 18909-100ML-F Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope  Nikon  A1

NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Fluorescence microscope  Nikon  TE200  Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum  Nacali Tesque 12389-96
Plant Growth Chambers SANYO  Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter Millipore SLGV033RS

Referenzen

  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Bao, L., Running, M. P. 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens. J. Vis. Exp. (192), e64651, doi:10.3791/64651 (2023).

View Video