ここでは、高い、長期にわたる、安定したオンターゲットサイレンシング効率と、低いゲノムワイドなオフターゲット活性を持つ、遺伝子操作された転写抑制因子(ETR)の in vitro 選択のためのプロトコルを提示します。このワークフローにより、候補となるETRの初期の複雑なレパートリーを、治療上重要な設定でのさらなる評価に適した短いリストに減らすことができます。
遺伝子の不活性化は、遺伝子機能の研究に役立ち、幅広い疾患の治療のための有望な戦略を表しています。従来の技術では、RNA干渉は、部分的な標的の除去と生涯にわたる治療の必要性に悩まされています。一方、人工ヌクレアーゼはDNA二本鎖切断(DSB)を誘導することで安定した遺伝子不活性化が可能だが、最近の研究ではこのアプローチの安全性が疑問視されている。遺伝子操作された転写リプレッサー(ETR) による 標的エピジェネティック編集は、特定のETRの組み合わせを1回投与するだけで、DNA切断を誘発することなく耐久性のあるサイレンシングが得られるため、解決策となる可能性があります。
ETRは、プログラム可能なDNA結合ドメイン(DBD)と天然の転写抑制因子由来のエフェクターを含むタンパク質です。具体的には、ヒトDNMT3AとヒトDNMT3Lの触媒ドメインであるヒトZNF10のKRABドメインを備えた3つのETRの組み合わせが、ETR標的遺伝子に遺伝性の抑制的なエピジェネティック状態を誘導することが示されました。このプラットフォームのヒットアンドランの性質、ターゲットのDNA配列への影響の欠如、およびオンデマンドでのDNA脱メチル化によって抑圧状態に戻る可能性により、エピジェネティックサイレンシングはゲームチェンジャーツールになります。重要なステップは、オンターゲットを最大化し、オフターゲットサイレンシングを最小限に抑えるために、ターゲット遺伝子上の適切なETRの位置を特定することです。このステップを最終的な ex vivoまたは in vivo の前臨床設定で実行することは、面倒な場合があります。
本稿では、CRISPR/触媒死Cas9システムをETRのパラダイムDBDとしてとらえ、効率的なオンターゲットサイレンシングのためのトリプルETRの組み合わせと組み合わせたガイドRNA(gRNA)の in vitro スクリーニングと、それに続くトップヒットのゲノムワイド特異性プロファイルの評価からなるプロトコルについて説明しています。これにより、候補gRNAの初期レパートリーを有望なgRNAの短いリストに減らすことができ、その複雑さは、治療的に関連性のある関心のある設定での最終評価に適しています。
遺伝子の不活性化は、従来、細胞モデルと動物モデルの両方で遺伝子機能を研究する上で重要な役割を果たしてきました。さらに、過去20年間で、遺伝子治療の台頭により、機能獲得型変異1、感染症2、またはある遺伝子のサイレンシングが別の遺伝子の遺伝性欠陥を補う可能性のある病状3によって引き起こされる疾患を治療するための潜在的に革新的なアプローチとして提案されてきました。最後に、がん免疫療法4および再生医療5のための細胞産物の効率を高めるために、細胞の適応度と機能制御の主要な調節因子の遺伝子不活性化が提案されている。
遺伝子不活性化を達成するためのさまざまな技術の中で、最も有望なものの1つは、標的エピジェネティックサイレンシング6,7です。この技術の中核をなすのは、プログラム可能なDNA結合ドメイン(DBD)とエピジェネティックな抑制機能を持つエフェクタードメイン(ED)からなるキメラタンパク質、いわゆる遺伝子組換え転写抑制因子(ETR)です。ジンクフィンガータンパク質(ZFP)8、転写活性化因子様エフェクター(TALE)9、またはCRISPR/dCas910ベースのDBDは、EDをサイレンシングする標的遺伝子のプロモーター/エンハンサー配列に選択的につなぎ合わせるように設計することができます。一旦そこに着くと、ETRのEDは、使用される抑制ドメインに応じて、ヒストン修飾(H3K9 11,12またはH3K27 13メチル化、H3またはH4脱アセチル化14)およびCpG DNAメチル化15などのヘテロクロマチン誘導抑制エピジェネティックマークを課すことによってサイレンシング活性を実行します。
特に、着床前胚16で発生する内因性レトロウイルスの永久転写抑制の分子プロセスに触発されて、以下のEDを利用するために3つのETRの組み合わせが生成されました:i)ヒトZNF10のKrüppel関連ボックス(KRAB)ドメイン;ii)ヒトde novo DNAメチルトランスフェラーゼ3A(DNMT3A)の触媒ドメイン;iii)完全長ヒトDNAメチルトランスフェラーゼ3様(DNMT3L)。KRABは、高等脊椎動物におけるいくつかのZFPによって共有される保存された抑制ドメインであり17,18、そのサイレンシング活性は、主に、その後、ヌクレオソームリモデリングおよび脱アセチル化(NuRD)複合体21、H3K9ヒストンメチルトランスフェラーゼSETDB1 22、およびH3K9メチル化リーダーHP123を含むいくつかの他のヘテロクロマチン誘導剤20と相互作用する足場タンパク質をリクルートする能力に基づいている。とりわけ24。
DNMT3Aは、CpG配列25でDNA上のメチル基を積極的に転写します。DNMT3Aの触媒活性は、メチル基の転移に関与する触媒ドメインを欠くDNMT3Aの胚細胞および生殖細胞制限パラログであるDNMT3Lとの物理的会合によって増強される26,27。哺乳類遺伝子のプロモーター/エンハンサー要素に埋め込まれたCpGが豊富な領域(CpGアイランド(CGI)と呼ばれる)でのDNAメチル化は、通常、転写サイレンシングと関連している28。重要なことに、一旦沈着すると、CpGメチル化はUHRF1-DNMT1ベースの分子複合体によって有糸分裂全体を通して安定して受け継がれ得る29。
標的細胞におけるETRの安定した過剰発現は、時間の経過とともに生理学的標的部位からの内因性相互作用因子のオフターゲット活性およびスケルチのリスクが高まるため、問題となる可能性があります。しかしながら、単一ETR部分の一過性発現は、高効率で長期サイレンシングを誘導できず30、それらの治療応用を妨げる可能性がある。したがって、この分野における独創的なブレークスルーは、3つのKRAB、DNMT3A、およびDNMT3LベースのETRの組み合わせが相乗効果を発揮し、一過性にしか同時送達されない場合でも、標的遺伝子H3K9のプロモーター配列とCpGメチル化を課すことができるという証拠でした。これらはその後、有糸分裂を通して細胞によって読み取られて増殖し、複数のヒトおよびマウス細胞株、ならびに ex vivo 培養された初代細胞における遺伝性サイレンシングをもたらす30。
注目すべきは、ETRによって課されるエピジェネティックなサイレンシングは、標的(例えば、サイレンシングされた遺伝子座へのCRISPR/dCas9ベースのTET1 DNAデメチラーゼの動員)または薬理学的(DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤5-Azaの投与)DNA脱メチル化30、ETR関連の有害事象の場合の潜在的な解毒剤によって、要求に応じて元に戻すことができることである。3つのKRAB-、DNMT3A-、およびDNMT3LベースのEDを有するオールインワンETRも記載されており、タンパク質をコードする遺伝子の大部分に対して細胞株31,32で有意なサイレンシング効率が示されました。さらに、ETRを用いたいくつかの研究では、de novoCpGメチル化またはクロマチンアクセシビリティの変化に関して大きなオフターゲット活性はなく、高い安全性プロファイルが報告されています30,31,32。ただし、臨床応用の前に、新しく設計されたDBDを装備したETRの特異性プロファイルの専用分析が推奨されます。
臨床的観点からは、標的エピジェネティックサイレンシングは、RNA干渉(RNAi)ベースのノックダウン33と人工ヌクレアーゼベースの遺伝子破壊8の両方に決定的な利点をもたらす可能性があります。RNAiとは対照的に、標的エピジェネティックサイレンシングは、細胞ごとの標的の完全な除去を誘導する可能性があり、長期的なサイレンシングを確実にするための定期的な処理を必要としません。遺伝子破壊とは対照的に、DNA配列は変化せず、DNA二本鎖切断(DSB)の発生を回避します。DSBは、その後、アポトーシスと細胞周期停止を誘導し、機能的なp53経路34,35、特にマルチプレックス遺伝子編集設定では、染色体再構成35を持つ細胞に対する選択につながる可能性があります。さらに、非相同末端結合媒介性DNA DSB修復の不可逆的なモザイク結果を中継することによって36、遺伝子破壊は、最終結果の1つとして、標的の機能的コード配列へのインフレーム修復を避けることができず、エピジェネティックサイレンシングとは対照的に、要求に応じて消去することができない。
最後に、エピジェネティックサイレンシングは、非転写調節要素やノンコーディングRNAなど、RNAiおよび遺伝子破壊に対して完全または少なくとも部分的に抵抗性のクラスに、標的化可能な遺伝的要素の範囲を広げる可能性を秘めています30,32。ターゲットエピジェネティックサイレンシングアプリケーションの最初の重要なステップは、標的遺伝子のさまざまな調節配列をカバーするETRのパネルを設計し、最もパフォーマンスの高いものを特定することです。常に開発中のプログラム可能なDNA結合技術によって標的とすることができるゲノムの部分が増加していることを考えると、テストされるETRの数は非常に重要です37。標的遺伝子を治療的にサイレンシングする細胞タイプに対してETRのスクリーニングを直接行うことが、最も適切な選択肢となります。しかし、ハイスループットスクリーニングは、培養中での生存期間が限られており、エンジニアリング能力が最適でないことが多いため、初代細胞では技術的に扱いにくい場合があります。大規模なスクリーニングは、in vivoではさらに実現不可能になる可能性があります。
より実用的な代替案は、最初に簡単に操作可能な細胞株でETRの大規模なパネルの初期スクリーニングを実施し、次に治療上重要な細胞タイプで最も有望なもののみを検証することです。これと並行して、ETRの消音効率を測定するための適切な読み出しを選択することも課題です。RT-qPCR、ウェスタンブロット、またはELISAによる標的遺伝子の転写産物またはタンパク質レベルの直接評価は、コストと時間がかかり、十分な感度を欠く可能性があるため、ハイスループットスケールでのアプリケーションが制限される可能性があります。蛍光色素を標的遺伝子の調節配列の転写制御下に置いた アドホック 改変レポーター細胞株の作製により、フローサイトメトリーベースのアプローチを利用して、単一細胞レベルでハイスループットペースでエピジェネティックサイレンシングを読み取ることができます。
これらの一般的な考慮事項に従って、この論文では、オンターゲットサイレンシング効率のためのETRの in vitro アレイスクリーニングと、それに続くトップヒットのゲノムワイドなオフターゲット活性の評価で構成されるプロトコルについて説明します。このワークフローにより、候補となるETRの初期レパートリーを、治療上重要な目的の細胞タイプでの最終評価に適した複雑さを持つ有望なETRの短いリストに減らすことができます。
ETRの生成に利用できるさまざまなプログラム可能なDBDの中で、このプロトコルでは、標的遺伝子プロモーターにまたがるgRNAをハイスループットスケールで設計することが容易であるため、CRISPR/dCas9ベースの技術に焦点を当てます。ただし、以下で説明するのと同じ概念ワークフローを採用して、他のDBDを備えたETRの効率と特異性を評価することができます。
標的エピジェネティックサイレンシングは、機能獲得型変異によって引き起こされる疾患1、感染症2、およびある遺伝子のサイレンシングが別の遺伝子の遺伝性欠陥を補う3か、養子細胞療法の可能性を最大限に引き出す4病状など、永久的な遺伝子不活性化の恩恵を受けることができる疾患を治療するための有望な解決策となる可能性があります。5.クロマチンレベルで作用し、細胞7,30,32によって自動増殖することにより、エピジェネティックサイレンシングは、標的遺伝子のDNA配列の毒性変化(例えば、染色体再構成)および標的の部分的で一過性のサイレンシングを回避することができ、これらはそれぞれ人工ヌクレアーゼベースの遺伝子破壊8,34,35およびRNAiベースのノックダウン33の限界である。
エピジェネティックサイレンシングプロトコルにおける重要な予備ステップの1つは、ターゲットの転写活性をオフにするために必要な抑制的なエピジェネティックマークを沈着させるETRを指示するために、ターゲット遺伝子上の適切な位置を特定することです。異なる転写開始部位-近位および遠位の調節要素は、所与のヒト遺伝子の転写出力を支持するために一致し得る54。さらに、プログラム可能なDNA結合技術の数が増えているおかげで、特定の調節要素ごとに異なる標的部位を同定できるようになりました6。したがって、遺伝子組換え細胞株でここに記載されているようなプロトコルを使用して、最終的な治療環境で最良の候補の煩雑で時間のかかる評価作業に着手する前に、ETRを介したエピジェネティックサイレンシングに適した個々の標的部位および/またはゲノム領域を指名することができます。プロトコルのいくつかの重要な側面について、以下で詳しく説明します。
最終治療標的を予測するレポーター細胞株のエンジニアリング
蛍光レポーターのコードするカセットを標的遺伝子に挿入し、ETRを送達するために、細胞工学プロトコルの絶え間ない最適化が行われているにもかかわらず、最終的な治療標的に最もよく似た細胞株でETRがすでに利用可能であることは当然のこととは考えられません。この場合、異なる緩和戦略を適用することができます:a)ベンダーが提供する最適化キットを利用して、標的細胞株のトランスフェクションプロトコルを社内で最適化する。b)工学プロトコルが広範囲に最適化されている最終治療標的以外の組織に属する、まだその標的遺伝子を発現しているが、他の細胞株に切り替える。これらの選択肢が利用できない場合は、最終標的となる初代細胞タイプまたはオルガノイドへの切り替えを検討することができます。ETRベースのエピジェネティックサイレンシングの前臨床試験と治療応用の両方における一般的な考慮事項として、標的遺伝子が標的細胞タイプに必須であるシナリオは破棄する必要があります。ETRによって課せられた必須遺伝子の完全かつ長期的なサイレンシングは、時間の経過とともに標的細胞の逆選択につながります(そして、潜在的には治療の毒性)。このような場合には、RNAi33などの部分的な標的除去を提供する代替技術が好まれます。
ETRのオンターゲットサイレンシング活性の評価
KRAB、DNMT3A、およびDNMT3Lエフェクタードメインの組み合わせに基づくETRは、転写開始部位を中心とする約1キロ塩基の広いロングパーミッシブターゲティングウィンドウにより、タンパク質をコードする遺伝子の大部分に対して有効であることが証明されています32。エピジェネティックなサイレンシング実験がどのようなものかを理解するために、K-562細胞における B2M 遺伝子のサイレンシングの技術的な詳細と結果をここに掲載します。これは、K-562細胞を扱う研究者だけでなく、ETRベースの技術に初めてアプローチする研究者にも含まれる重要なポジティブコントロールと見なすことができます。プロトコルに記載されているように、人工ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9など)ベースの遺伝子破壊は、目的の細胞タイプにおける遺伝子送達の効率と、標的遺伝子を奪われた細胞の表現型の両方の追加の制御として推奨されます。CRISPR/dCas9ベースのETRと結合するgRNAの最初のスクリーニング後、テストされたgRNAのいずれも標的遺伝子を永久にサイレンシングできない場合は、次の順序で検討する必要があります:1)送達されるgRNAとETRの量を増やす。2)上位gRNAのプールをテストし、それらの間の相乗効果を探します。それでも長期的なサイレンシングが達成されない場合は、次のことを検討する必要があります:3)エピジェネティックサイレンシングを指示するためにより関連性の高い部位を標的とする可能性のある追加のgRNAのテスト。4)ZFP8またはTALE9ベースのDBDプラットフォームに切り替えると、標的クロマチンへの結合能力が向上する可能性があります。5)一過性から安定への切り替え-例えば、ETR(CRISPR/dCas9技術を採用する場合は、gRNAまたはdCas9融合コンストラクトのいずれか、またはその両方)のウイルスベクターベースの発現を統合する。私たちのグループは、3つの別々のETR30の共同デリバリーを開発し、豊富な経験を持っているため、ここに示したプロトコルと結果は、このアプローチに基づいています。しかしながら、同様の概念的ワークフローは、オールインワンCRISPRベースのシステム32にも適用され得る可能性が高い。
ETRのオフターゲット活性の評価
複数の研究により、KRAB、DNMT3A、およびDNMT3Lエフェクタードメインの組み合わせに基づくETRの特異性の予備的なin vitro適応症が示されています30,31,32。しかし、試験したgRNAの中で、転写調節および/またはde novoDNAメチル化に関して満足のいく特異性プロファイルを示さない場合は、2つの非相互に排他的な戦略を追求することができます:a)ETRの用量を減らすか、代替送達システムをテストすることにより、細胞内のETRの滞留時間(およびその結果、潜在的なオフターゲット活性)を短縮します。例えば、プラスミドと比較して、mRNAとタンパク質の送達はどちらも、ETRへの細胞曝露時間を短縮し、その結果、オフターゲット活性の可能性を低減することが期待されます55。b)プラットホーム56のオフターゲット結合を減少させるように最適化された、より最近のCas9変異体への切り替え、または代替的なZFP8−またはTALE9ベースのDNA結合技術への切り替え。模擬処理されたサンプルと比較して、遺伝子サイレンシングのオンターゲットおよびオフターゲット活性は、DBDの標的配列への結合だけでなく、エピジェネティックエフェクタードメインが天然の内因性補因子によって他の遺伝子座にリクルートされる潜在的な能力によっても影響を受けることを考慮することが重要です。したがって、標的細胞におけるETRの滞留時間を短縮すると、DBDがオフターゲット部位に結合する可能性が低下するだけでなく、ETRが内因性補因子と相互作用する可能性も低下し、特異性の点でメリットがあり、オンターゲット活性の点でデメリットが生じる可能性があります。最後に、模擬処理されたサンプルと比較して、サイレンサー細胞で測定された転写および可能性の低いCpGメチル化変化の一部は、標的遺伝子の欠乏によって単純に導き出すことができます。これらは、サイレンシング技術のオフターゲットとは見なされません。それらを同定するには、人工ヌクレアーゼによる遺伝子破壊も実験パネルに含める必要があります8,9,10。標的遺伝子の機能喪失による生物学的変化は、エピジェネティックサイレンシングとこの代替技術の間で共有されます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、長年にわたるエピジェネティックサイレンシング技術の開発に協力してくれたAngelo Amabile氏、Paola Capasso氏、Ilaria Caserta氏、Tania Baccega氏、Alice Reschigna氏、Valeria Mollica氏、Deborah Cipria氏に感謝します。Dejan Lazarevic と Francesca Giannese は、プロトコルに記載されている RNA-seq および MeDIP-seq 解析の批判的レビューについて述べています。この研究は、Telethon Foundation(TIGET助成金番号F1)およびEU Horizon 2020プログラム(UPGRADE)からのA.L.への助成金によって支援されました。イラストは BioRender.com で作成されています。
著者の貢献
A.M.、M.A.C.、F.G.、およびA.C.は、プロトコルの設計と原稿の作成に貢献しました。S.V.、I.M.、およびD.C.は、プロトコルのバイオインフォマティクスセクションを設計し、原稿を改訂しました。A.M.とA.L.は、すべての著者の意見を取り入れてプロトコルを設計し、原稿を考案し、執筆しました。
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |