Summary

Quantificação e Análise Baseada em Citometria de Fluxo de Células B do Miocárdio

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Relatamos aqui um protocolo para a quantificação e diferenciação de linfócitos B miocárdicos com base em sua localização no espaço intravascular ou endotelial utilizando citometria de fluxo.

Abstract

Um crescente corpo de evidências mostra que os linfócitos B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e da adaptação miocárdica à lesão. No entanto, a literatura relata dados contrastantes sobre a prevalência de células B miocárdicas. Foi relatado que as células B estão entre as células imunes mais prevalentes no coração do roedor ou estão presentes, mas com uma prevalência marcadamente menor do que as células mielóides, ou como sendo bastante raras. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado. A implementação de um método compartilhado e reprodutível para avaliar a prevalência de células B miocárdicas é fundamental para harmonizar as observações de diferentes grupos de pesquisa e, assim, promover o avanço do estudo das interações miocárdicas de células B. Com base em nossa experiência, as observações aparentemente contrastantes relatadas na literatura provavelmente decorrem do fato de que as células B miocárdicas murinas são principalmente intravasculares e conectadas ao endotélio microvascular. Portanto, o número de células B recuperadas de um coração murino é extremamente sensível às condições de perfusão usadas para limpar o órgão e ao método de digestão usado. Aqui relatamos um protocolo otimizado que leva em conta essas duas variáveis críticas de uma maneira específica. Este protocolo capacita a análise reprodutível, baseada em citometria de fluxo, do número de células B miocárdicas murinas e permite que os pesquisadores distingam células B miocárdicas extravasculares versus intravasculares.

Introduction

Os linfócitos B são células imunes altamente especializadas que desempenham um papel importante nas respostas imunes adaptativas e inatas1. Existem duas populações principais de células B: uma população menor de células B1 que são produzidas principalmente durante a vida embrionária, e uma população preponderante de células B2 que são produzidas na vida adulta na medula óssea1. Após a maturação na medula óssea, as células B migram para os órgãos linfoides primários e secundários. A partir daí, recirculam continuamente entre os órgãos linfoides que viajam através dos vasos sanguíneos e dos vasos linfáticos2. As células B expressam anticorpos específicos em sua superfície, que funcionam como receptores. Quando as células B encontram um antígeno que se liga ao seu receptor, um sinal de ativação pode ser acionado. As células B ativadas migram para o tecido onde o antígeno foi encontrado ou retornam à medula óssea, onde podem amadurecer em plasmócitos produtores de anticorpos 3,4.

Recentemente, tem sido apreciado que o coração abriga uma população considerável de células B. Estudos em roedores mostraram que as células B colonizam o coração precocemente durante o desenvolvimento embrionário5, e que as células B associadas à miocárdia são principalmente intravasculares, células B2 ingênuas aderidas ao endotélio6,7, com uma pequena porcentagem de células B1 7. Ainda existem muitas áreas de incerteza, mas os dados disponíveis indicam que as células B desempenham um papel importante tanto no coração ingênuo quanto no contexto da adaptação miocárdica à lesão.

Estudos no coração murino ingênuo mostraram que, no início do estudo, as células B miocárdicas estão localizadas principalmente no espaço intravascular, aderidas ao endotélio (>95% das células B cardíacas murinas estavam localizadas no espaço intravascular). Verificou-se que essas células B têm padrões de expressão gênica diferentes daqueles das células B circulantes isoladas do sangue periférico. A análise de corações ingênuos de animais deficientes em células B e controles singênicos descobriu que os animais sem células B tinham corações menores e maior fração de ejeção6. Todas essas evidências sugerem que as células B podem modular o crescimento miocárdico e/ou a função miocárdica, e que não apenas as células B intersticiais, mas também intravasculares, podem ser responsáveis por tais observações. Observou-se também que as células B modulam o fenótipo dos macrófagos residentes no miocárdio8.

Diversos estudos têm demonstrado que as células B desempenham um papel importante no contexto da adaptação miocárdica à lesão 8,9,10,11,12,13. As células B se acumulam transitoriamente no coração lesado, provavelmente através de um mecanismo dependente da CXCL13-CXCR511,13. A partir daí, as células B promovem o remodelamento cardíaco adverso por meio de vários mecanismos que incluem o recrutamento de monócitos mediados por citocinas 9,12. Além disso, as células B podem produzir anticorpos contra proteínas cardíacas que podem promover a extensão do dano cardíaco e o remodelamento cardíaco adverso através de diversos mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . As células B também podem exercer efeitos protetores sobre o coração lesado através da secreção de IL-1010.

À medida que cresce o número de grupos que investigam o papel das células B no coração ingênuo e lesado, torna-se cada vez mais importante definir protocolos compartilhados para quantificar e avaliar adequadamente as células B miocárdicas e, assim, evitar inconsistências que já começaram a aparecer na literatura. Até agora, as células B têm sido relatadas como sendo uma das células imunes mais prevalentes no coração de roedores7 e estando presentes em uma prevalência marcadamente menor do que as células mieloides26,27, ou como sendo bastante raras28. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda 7,9,13, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado29. Estudos sobre células imunes cardíacas raramente dão detalhes sobre as condições de perfusão e não há consenso sobre as condições de digestão. Como no coração de roedores uma grande proporção de células B é intravascular e a extração de células imunes do miocárdio é altamente dependente do método de digestão utilizado, as diferenças relatadas na literatura podem ser o resultado de diferenças na perfusão de órgãos e digestão tecidual.

Apresenta-se aqui um método detalhado para quantificação baseada em citometria de fluxo de células B miocárdicas murinas que maximiza o rendimento da recuperação de células B, otimizando as condições de perfusão e digestão e permite a discriminação de células B miocárdicas intravasculares versus extravasculares6. Esse protocolo é uma adaptação e otimização de outros protocolos similares que distinguem entre células imunes intravasculares e intersticiais 28,30,31.

Neste protocolo, padronizamos a perfusão miocárdica para eliminar as células B que flutuam no espaço intravascular sem remover as células B biologicamente relevantes aderidas ao endotélio microvascular. Além disso, com base em protocolos anteriores que descreveram o uso de injeção intravenosa de anticorpos para distinguir células imunes intravasculares de intersticiais32, e aproveitando o fato de que as células B expressam o marcador de superfície B22033, demonstramos como distinguir células B miocárdicas intravasculares versus extravasculares através da injeção intravascular de um anticorpo específico B220 imediatamente antes do sacrifício animal e da perfusão cardíaca. Este protocolo é relevante para a pesquisa de qualquer cientista interessado em incluir a análise de células B miocárdicas no coração ingênuo e ferido. A implementação generalizada deste protocolo reduzirá as inconsistências entre os grupos de pesquisa, permitirá a análise de alterações nos pools intravascular e extravascular de células B miocárdicas e, assim, reforçará o avanço das descobertas no campo da imunologia cardíaca.

Em resumo, o protocolo representa um fluxo de trabalho otimizado para quantificar e analisar as células B miocárdicas via citometria de fluxo e, ao mesmo tempo, distinguir entre as células localizadas no espaço extravascular e no espaço intravascular.

Protocol

Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados com a aprovação da IACUC da Johns Hopkins University School of Medicine. 1. Preparações Prepare o buffer FACS, conforme descrito na Tabela 1. Certifique-se de que há CO2 suficiente para eutanasiar os animais. Prepare o espaço de dissecação (coloque a almofada de bancada e coloque a fita adesiva e as ferramentas de dissecação nas proximidades).</…

Representative Results

Uma vez concluída a aquisição e coletados todos os eventos, os dados devem ser analisados de acordo com a prática padrão de citometria de fluxo. O foco da análise irá variar dependendo do objetivo individual de cada experimento. Neste caso, a quantificação de células B intravasculares e extravasculares foi buscada, e foi expressa como o número de células por mg de tecido. Ao usar um citômetro espectral, recomenda-se iniciar a análise com um bloqueio inicial para remover detritos …

Discussion

Um crescente corpo de evidências indica que as células B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e do remodelamento/adaptação miocárdica à lesão 7,8,9,10,11,12,13,36. A citometria de fluxo é uma excelente ferramenta par…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado pelas bolsas NHLBI 5K08HLO145108-03 e 1R01HL160716-01 concedidas a Luigi Adamo.

O citômetro de fluxo Aurora usado para desenvolver este estudo foi financiado pelo NIH Grant S10OD026859. Reconhecemos o apoio do JHU Ross Flow Cytometry Core.

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody 101222 BioLegend 100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue QBIAP303 Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1605-0000 SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP 114-055-101 Quality Biological 0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1615-5500 SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips 11213810 USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips 11267810 USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430052 Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT951 ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol T48402 Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips 11208810 USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT953 ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style 352054 Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430290 Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer 118-156-101 Quality Biological Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 22638289 Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 22638246 Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 UPC 109153 Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse RWD-AICMV-100 Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL 309626 BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack CMD 2613 Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody 115537 BioLegend 50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile T9009 Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940  CD USPE AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL UX-34502-46 Cole-Parmer
Collagenase 2 LS004176 Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb Y992611-AG AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP M-08-12 AirGas USA
DNase I – 40,000 U D4527 Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller 4430000018 Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E 30100606 Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge 5810R Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes Eppendorf
FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) Z740287 Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] 14025076 gibco 1x
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight 13018-14 Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL 302831 BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 M1-940-PG AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate 4033-CS150 McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance NV2201 Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] 10010023 gibco 1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody 103208 BioLegend 200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody 103132 BioLegend 100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene FB0875711YZ Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 M08-1 AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator LED-6W AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) 305122 BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) 553141 BD Becton, Dickinson and Company Biosciences 0.5 mg/mL
R 4.1.1 The R Foundation
Razor Blades 9501250000 Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet Y12244A320-AG AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets Rotor A-4-62 Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister 86.1254.001 Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape L8394 Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0 Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA MTLL230-6005 Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long CG-730-003 Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL Z683566 Millipore Sigma
Syringe pump 55-1199 (95-240) Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 9371W13 Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119835 Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119827 Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. T8913 (Millipore Sigma) Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2 SI-0236 Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips 89259-946 Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" 82027-578 Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I 12620-946 Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit 423102 BioLegend

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Diesen Artikel zitieren
Bermea, K. C., Rousseau, S. T., Adamo, L. Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells. J. Vis. Exp. (186), e64344, doi:10.3791/64344 (2022).

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