Summary

Quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules B myocardiques

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Nous rapportons ici un protocole pour la quantification et la différenciation des lymphocytes B myocardiques en fonction de leur emplacement dans l’espace intravasculaire ou endothélial en utilisant la cytométrie de flux.

Abstract

Un nombre croissant de preuves montre que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et de l’adaptation myocardique aux blessures. Cependant, la littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Il a été rapporté que les cellules B étaient à la fois parmi les cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs ou qu’elles étaient présentes, mais à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes, ou qu’elles étaient assez rares. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de cellules B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de cellules B du myocarde lésé. La mise en œuvre d’une méthode partagée et reproductible pour évaluer la prévalence des lymphocytes B myocardiques est essentielle pour harmoniser les observations des différents groupes de recherche et ainsi favoriser l’avancement de l’étude des interactions myocardiques des lymphocytes B. D’après notre expérience, les observations apparemment contrastées rapportées dans la littérature proviennent probablement du fait que les cellules B myocardiques murines sont principalement intravasculaires et connectées à l’endothélium microvasculaire. Par conséquent, le nombre de cellules B récupérées dans un cœur murin est extrêmement sensible aux conditions de perfusion utilisées pour nettoyer l’organe et à la méthode de digestion utilisée. Nous rapportons ici un protocole optimisé qui tient compte de ces deux variables critiques d’une manière spécifique. Ce protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux du nombre de cellules B myocardiques murines et permet aux chercheurs de distinguer les cellules B myocardiques extravasculaires des cellules B intravasculaires.

Introduction

Les lymphocytes B sont des cellules immunitaires hautement spécialisées qui jouent un rôle important dans les réponses immunitaires adaptatives et innées1. Il existe deux populations principales de cellules B : une plus petite population de cellules B1 qui sont principalement produites au cours de la vie embryonnaire, et une population prépondérante de cellules B2 qui sont produites à l’âge adulte dans la moelle osseuse1. Après avoir mûri dans la moelle osseuse, les cellules B migrent vers les organes lymphoïdes primaires et secondaires. De là, ils recirculent continuellement entre les organes lymphoïdes voyageant à travers les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques2. Les cellules B expriment des anticorps spécifiques à leur surface, qui fonctionnent comme des récepteurs. Lorsque les cellules B rencontrent un antigène qui se lie à leur récepteur, un signal d’activation peut être déclenché. Les lymphocytes B activés migrent vers le tissu où l’antigène a été trouvé ou retournent dans la moelle osseuse où ils peuvent devenir des plasmocytes producteurs d’anticorps 3,4.

Récemment, il a été reconnu que le cœur abrite une population importante de cellules B. Des études chez les rongeurs ont montré que les lymphocytes B colonisent le cœur au début du développement embryonnaire5, et que les lymphocytes B associés au myocarde sont pour la plupart intravasculaires, des cellules B2 naïves adhérant à l’endothélium6,7, avec un faible pourcentagede cellules B17. Il existe encore de nombreuses zones d’incertitude, mais les données disponibles indiquent que les cellules B jouent un rôle important à la fois dans le cœur naïf et dans le contexte de l’adaptation myocardique aux blessures.

Des études sur le cœur murin naïf ont montré qu’au départ, les cellules B myocardiques sont principalement situées dans l’espace intravasculaire, adhèrent à l’endothélium (>95% des cellules B cardiaques murines se sont avérées être situées dans l’espace intravasculaire). On a constaté que ces cellules B avaient des schémas d’expression génique différents de ceux des cellules B circulantes isolées du sang périphérique. L’analyse des cœurs naïfs d’animaux déficients en lymphocytes B et de témoins syngéniques a révélé que les animaux dépourvus de lymphocytes B avaient des cœurs plus petits et une fraction d’éjection6 plus élevée. Toutes ces preuves suggèrent que les cellules B pourraient moduler la croissance myocardique et / ou la fonction myocardique, et que non seulement les cellules B interstitielles mais aussi intravasculaires pourraient être responsables de ces observations. Les cellules B ont également été trouvées pour moduler le phénotype des macrophages résidents du myocarde8.

Plusieurs études ont montré que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de l’adaptation myocardique aux lésions 8,9,10,11,12,13. Les lymphocytes B s’accumulent transitoirement dans le cœur blessé, probablement par un mécanisme dépendant de CXCL13-CXCR511,13. À partir de là, les cellules B favorisent le remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes, dont le recrutement demonocytes médiés par les cytokines 9,12. En outre, les cellules B peuvent produire des anticorps contre les protéines cardiaques qui peuvent favoriser l’extension des lésions cardiaques et du remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Les cellules B peuvent également exercer des effets protecteurs sur le cœur blessé par la sécrétion d’IL-1010.

Alors que le nombre de groupes étudiant le rôle des cellules B dans le cœur naïf et blessé augmente, il devient de plus en plus important de définir des protocoles partagés pour quantifier et évaluer correctement les cellules B myocardiques et ainsi éviter les incohérences qui ont déjà commencé à apparaître dans la littérature. Jusqu’à présent, les cellules B ont en fait été signalées comme étant l’une des cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs7 et présentes à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes26,27, ou assez rares 28. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de lymphocytes B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë 7,9,13, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de lymphocytes B du myocarde29 lésé. Les études sur les cellules immunitaires cardiaques donnent rarement des détails sur les conditions de perfusion et il n’y a pas de consensus sur les conditions de digestion. Étant donné que dans le cœur de rongeur, une grande proportion de cellules B sont intravasculaires et que l’extraction des cellules immunitaires du myocarde dépend fortement de la méthode de digestion utilisée, les différences rapportées dans la littérature pourraient être le résultat de différences dans la perfusion d’organes et la digestion tissulaire.

Présenté ici est une méthode détaillée pour la quantification basée sur la cytométrie de flux des cellules B myocardiques murines qui maximise le rendement de la récupération des cellules B en optimisant les conditions de perfusion et de digestion et permet la discrimination des cellules B myocardiques intravasculaires vs extravasculaires6. Ce protocole est une adaptation et une optimisation d’autres protocoles similaires qui distinguent les cellules immunitaires intravasculaires et interstitielles 28,30,31.

Dans ce protocole, nous normalisons la perfusion myocardique pour éliminer les cellules B flottant dans l’espace intravasculaire sans éliminer les cellules B biologiquement pertinentes adhérant à l’endothélium microvasculaire. De plus, en nous appuyant sur des protocoles antérieurs qui ont décrit l’utilisation de l’injection intraveineuse d’anticorps pour distinguer les cellules immunitaires intravasculaires des cellules immunitaires interstitielles32, et en tirant parti du fait que les cellules B expriment le marqueur de surface B22033, nous démontrons comment distinguer les cellules B myocardiques intravasculaires des cellules B extravasculaires par injection intravasculaire d’un anticorps spécifique B220 immédiatement avant le sacrifice animal et la perfusion cardiaque. Ce protocole est pertinent pour la recherche de tout scientifique intéressé à inclure l’analyse des cellules B myocardiques dans le cœur naïf et blessé. La mise en œuvre généralisée de ce protocole réduira les incohérences entre les groupes de recherche, permettra l’analyse des changements dans les pools de lymphocytes B myocardiques intravasculaires et extravasculaires, et renforcera ainsi l’avancement des découvertes dans le domaine de l’immunologie cardiaque.

En résumé, le protocole représente un flux de travail optimisé pour quantifier et analyser les cellules B myocardiques via la cytométrie en flux, tout en distinguant les cellules situées dans l’espace extravasculaire et l’espace intravasculaire.

Protocol

Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées avec l’approbation de l’IACUC à la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins. 1. Préparatifs Préparer le tampon FACS, tel que décrit dans le tableau 1. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de CO2 pour euthanasier les animaux. Préparez l’espace de dissection (placez le paillasse et placez le ruban adhésif et les outils de …

Representative Results

Une fois l’acquisition terminée et tous les événements collectés, les données doivent être analysées conformément à la pratique standard de cytométrie en flux. L’objet de l’analyse variera en fonction de l’objectif individuel de chaque expérience. Dans ce cas, la quantification des cellules B intravasculaires et extravasculaires a été poursuivie, et elle a été exprimée en nombre de cellules par mg de tissu. Lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral, il est reco…

Discussion

Un nombre croissant de preuves indique que les cellules B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et du remodelage/adaptation myocardique aux blessures 7,8,9,10,11,12,13,36. La cytométrie en flux est un excellent outil pour…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par les subventions NHLBI 5K08HLO145108-03 et 1R01HL160716-01 accordées à Luigi Adamo.

Le cytomètre en flux Aurora utilisé pour développer cette étude a été financé par la subvention NIH S10OD026859. Nous reconnaissons le soutien du JHU Ross Flow Cytometry Core.

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody 101222 BioLegend 100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue QBIAP303 Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1605-0000 SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP 114-055-101 Quality Biological 0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1615-5500 SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips 11213810 USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips 11267810 USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430052 Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT951 ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol T48402 Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips 11208810 USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT953 ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style 352054 Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430290 Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer 118-156-101 Quality Biological Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 22638289 Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 22638246 Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 UPC 109153 Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse RWD-AICMV-100 Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL 309626 BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack CMD 2613 Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody 115537 BioLegend 50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile T9009 Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940  CD USPE AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL UX-34502-46 Cole-Parmer
Collagenase 2 LS004176 Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb Y992611-AG AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP M-08-12 AirGas USA
DNase I – 40,000 U D4527 Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller 4430000018 Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E 30100606 Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge 5810R Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes Eppendorf
FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) Z740287 Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] 14025076 gibco 1x
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight 13018-14 Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL 302831 BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 M1-940-PG AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate 4033-CS150 McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance NV2201 Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] 10010023 gibco 1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody 103208 BioLegend 200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody 103132 BioLegend 100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene FB0875711YZ Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 M08-1 AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator LED-6W AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) 305122 BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) 553141 BD Becton, Dickinson and Company Biosciences 0.5 mg/mL
R 4.1.1 The R Foundation
Razor Blades 9501250000 Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet Y12244A320-AG AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets Rotor A-4-62 Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister 86.1254.001 Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape L8394 Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0 Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA MTLL230-6005 Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long CG-730-003 Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL Z683566 Millipore Sigma
Syringe pump 55-1199 (95-240) Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 9371W13 Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119835 Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119827 Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. T8913 (Millipore Sigma) Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2 SI-0236 Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips 89259-946 Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" 82027-578 Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I 12620-946 Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit 423102 BioLegend

Referenzen

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier–an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy–impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

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Diesen Artikel zitieren
Bermea, K. C., Rousseau, S. T., Adamo, L. Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells. J. Vis. Exp. (186), e64344, doi:10.3791/64344 (2022).

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