Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.
Een groeiend aantal bewijzen toont aan dat B-lymfocyten een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale aanpassing aan letsel. De literatuur rapporteert echter contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Van B-cellen is gemeld dat ze zowel tot de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart behoren als aanwezig zijn, maar met een aanzienlijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen, of vrij zeldzaam zijn. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocardium. Implementatie van een gedeelde, reproduceerbare methode om de prevalentie van myocardiale B-cellen te beoordelen, is van cruciaal belang om waarnemingen van verschillende onderzoeksgroepen te harmoniseren en zo de voortgang van de studie van B-cel myocardiale interacties te bevorderen. Op basis van onze ervaring komen de schijnbaar contrasterende waarnemingen die in de literatuur worden gerapporteerd waarschijnlijk voort uit het feit dat muizenmyocardiale B-cellen meestal intravasculair zijn en verbonden met het microvasculaire endotheel. Daarom is het aantal B-cellen dat wordt teruggewonnen uit een muizenhart buitengewoon gevoelig voor de perfusieomstandigheden die worden gebruikt om het orgaan te reinigen en voor de gebruikte verteringsmethode. Hier rapporteren we een geoptimaliseerd protocol dat op een specifieke manier rekening houdt met deze twee kritieke variabelen. Dit protocol maakt reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde analyse van het aantal muizenmyocardiale B-cellen mogelijk en stelt onderzoekers in staat om extravasculaire versus intravasculaire myocardiale B-cellen te onderscheiden.
B-lymfocyten zijn zeer gespecialiseerde immuuncellen die een belangrijke rol spelen in zowel adaptieve als aangeboren immuunresponsen1. Er zijn twee hoofdpopulaties van B-cellen: een kleinere populatie van B1-cellen die meestal worden geproduceerd tijdens het embryonale leven, en een overheersende populatie van B2-cellen die in het volwassen leven in het beenmerg worden geproduceerd1. Na rijping in het beenmerg migreren B-cellen naar primaire en secundaire lymfoïde organen. Van daaruit recirculeren ze continu tussen lymfoïde organen die door bloedvaten en lymfevaten reizen2. B-cellen brengen specifieke antilichamen tot expressie op hun oppervlak, die functioneren als receptoren. Wanneer B-cellen een antigeen tegenkomen dat zich aan hun receptor bindt, kan een activerend signaal worden geactiveerd. Geactiveerde B-cellen migreren naar het weefsel waar het antigeen werd gevonden of gaan terug naar het beenmerg waar ze kunnen rijpen tot antilichaamproducerende plasmacellen 3,4.
Onlangs is het gewaardeerd dat het hart een aanzienlijke populatie B-cellen herbergt. Studies bij knaagdieren hebben aangetoond dat B-cellen het hart vroeg koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling5, en dat myocardiale geassocieerde B-cellen meestal intravasculaire, naïeve B2-cellen zijn die zich hechten aan het endotheel 6,7, met een klein percentage B1-cellen7. Er zijn nog veel gebieden van onzekerheid, maar de beschikbare gegevens geven aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen, zowel in het naïeve hart als in de context van myocardiale aanpassing aan letsel.
Studies in het naïeve muizenhart hebben aangetoond dat bij baseline myocardiale B-cellen zich meestal in de intravasculaire ruimte bevinden, gehecht aan het endotheel (>95% van de murine cardiale B-cellen bleken zich in de intravasculaire ruimte te bevinden). Deze B-cellen bleken genexpressiepatronen te hebben die verschillen van die van circulerende B-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed. Analyse van naïeve harten van B-cel-deficiënte dieren en syngene controles wees uit dat dieren zonder B-cellen kleinere harten en hogere ejectiefractie6 hadden. Al dit bewijs suggereert dat B-cellen de myocardiale groei en/of myocardiale functie kunnen moduleren, en dat niet alleen interstitiële maar ook intravasculaire B-cellen verantwoordelijk kunnen zijn voor dergelijke waarnemingen. B-cellen bleken ook het fenotype van myocardiale residente macrofagen te moduleren8.
Verschillende studies hebben aangetoond dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale aanpassing aan letsel 8,9,10,11,12,13. B-cellen hopen zich tijdelijk op in het gewonde hart, waarschijnlijk via een CXCL13-CXCR5-afhankelijk mechanisme11,13. Van daaruit bevorderen B-cellen nadelige cardiale remodellering via verschillende mechanismen, waaronder cytokine-gemedieerde monocytenrekrutering 9,12. Bovendien kunnen B-cellen antilichamen tegen harteiwitten produceren die de uitbreiding van hartschade en ongunstige hartremodellering kunnen bevorderen via verschillende mechanismen 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-cellen kunnen ook beschermende effecten uitoefenen op het gewonde hart door de afscheiding van IL-1010.
Naarmate het aantal groepen dat de rol van B-cellen in het naïeve en gewonde hart onderzoekt, groeit, wordt het steeds belangrijker om gedeelde protocollen te definiëren om myocardiale B-cellen goed te kwantificeren en te beoordelen en zo inconsistenties te voorkomen die al in de literatuur zijn begonnen te verschijnen. Tot nu toe zijn B-cellen in feite beide gemeld als een van de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart7 en aanwezig te zijn met een duidelijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen26,27, of vrij zeldzaam28. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct 7,9,13, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocard29. Studies op cardiale immuuncellen geven zelden details over perfusieomstandigheden en er is geen consensus over de spijsverteringscondities. Aangezien in het knaagdierhart een groot deel van de B-cellen intravasculair is en de extractie van immuuncellen uit het myocard sterk afhankelijk is van de gebruikte verteringsmethode, kunnen de in de literatuur gemelde verschillen het gevolg zijn van verschillen in orgaanperfusie en weefselvertering.
Hier gepresenteerd is een gedetailleerde methode voor flowcytometrie-gebaseerde kwantificering van murine myocardiale B-cellen die de opbrengst van B-celherstel maximaliseert door perfusie- en spijsverteringscondities te optimaliseren en de discriminatie van intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellenmogelijk maakt 6. Dit protocol is een aanpassing en optimalisatie van andere vergelijkbare protocollen die onderscheid maken tussen intravasculaire en interstitiële immuuncellen 28,30,31.
In dit protocol standaardiseren we myocardiale perfusie om B-cellen die in de intravasculaire ruimte zweven te elimineren zonder biologisch relevante B-cellen te verwijderen die aan het microvasculaire endotheel zijn gehecht. Bovendien, voortbouwend op eerdere protocollen die het gebruik van intraveneuze injectie van antilichamen hebben beschreven om intravasculaire van interstitiële immuuncellen te onderscheiden32, en gebruikmakend van het feit dat B-cellen de oppervlaktemarker B22033 tot expressie brengen, demonstreren we hoe intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellen kunnen worden onderscheiden door intravasculaire injectie van een B220-specifiek antilichaam onmiddellijk vóór het dierenoffer en de hartperfusie. Dit protocol is relevant voor het onderzoek van elke wetenschapper die geïnteresseerd is in het opnemen van de analyse van myocardiale B-cellen in het naïeve en gewonde hart. De wijdverspreide implementatie van dit protocol zal inconsistenties tussen onderzoeksgroepen verminderen, zal de analyse van veranderingen in de intravasculaire en extravasculaire myocardiale B-celpools mogelijk maken en zo de vooruitgang van ontdekkingen op het gebied van cardiale immunologie ondersteunen.
Samenvattend vertegenwoordigt het protocol een geoptimaliseerde workflow om myocardiale B-cellen te kwantificeren en te analyseren via flowcytometrie, en tegelijkertijd onderscheid te maken tussen cellen in de extravasculaire ruimte en de intravasculaire ruimte.
Een groeiend aantal aanwijzingen geeft aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale remodellering / aanpassing aan letsel 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometrie is een uitstekend hulpmiddel om immuuncelpo…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gefinancierd door NHLBI-subsidies 5K08HLO145108-03 en 1R01HL160716-01 toegekend aan Luigi Adamo.
De Aurora Flow Cytometer die werd gebruikt om deze studie te ontwikkelen, werd gefinancierd door NIH Grant S10OD026859. We erkennen de steun van de JHU Ross Flow Cytometry Core.
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
R 4.1.1 | The R Foundation | ||
Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |