Her rapporterer vi en protokol til kvantificering og differentiering af myokardie B-lymfocytter baseret på deres placering i det intravaskulære eller endotelrum ved hjælp af flowcytometri.
En voksende mængde beviser viser, at B-lymfocytter spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardietilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten af myokardie-B-celler. B-celler er rapporteret at være både blandt de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet eller at være til stede, men med en markant lavere forekomst end myeloide celler, eller at være ret sjældne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardie. Implementering af en delt, reproducerbar metode til vurdering af forekomsten af myokardiale B-celler er afgørende for at harmonisere observationer fra forskellige forskningsgrupper og dermed fremme udviklingen af undersøgelsen af B-celle myokardieinteraktioner. Baseret på vores erfaring stammer de tilsyneladende kontrasterende observationer, der er rapporteret i litteraturen, sandsynligvis fra det faktum, at murine myokardie B-celler for det meste er intravaskulære og forbundet med det mikrovaskulære endotel. Derfor er antallet af B-celler, der genvindes fra et murinhjerte, udsøgt følsomt over for de perfusionsbetingelser, der anvendes til at rense organet og til den anvendte fordøjelsesmetode. Her rapporterer vi en optimeret protokol, der tager højde for disse to kritiske variabler på en bestemt måde. Denne protokol muliggør reproducerbar, flowcytometribaseret analyse af antallet af murine myokardie-B-celler og giver forskere mulighed for at skelne ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardie-B-celler.
B-lymfocytter er højt specialiserede immunceller, der spiller en vigtig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Der er to hovedpopulationer af B-celler: en mindre population af B1-celler, der for det meste produceres i embryonalt liv, og en overvejende population af B2-celler, der produceres i voksenlivet i knoglemarven1. Efter modning i knoglemarven migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra recirkulerer de kontinuerligt mellem lymfoide organer, der rejser gennem blodkar og lymfekar2. B-celler udtrykker specifikke antistoffer på deres overflade, som fungerer som receptorer. Når B-celler støder på et antigen, der binder til deres receptor, kan et aktiverende signal udløses. Aktiverede B-celler migrerer enten til det væv, hvor antigenet blev fundet, eller går tilbage til knoglemarven, hvor de kan modnes til antistofproducerende plasmaceller 3,4.
For nylig er det blevet værdsat, at hjertet har en betydelig population af B-celler. Undersøgelser af gnavere har vist, at B-celler koloniserer hjertet tidligt under embryonal udvikling5, og at myokardieassocierede B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler klæbet til endotelet6,7, med en lille procentdel af B1-celler7. Der er stadig mange områder med usikkerhed, men de tilgængelige data indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle både i det naive hjerte og i forbindelse med myokardietilpasning til skade.
Undersøgelser i det naive murinhjerte har vist, at myokardie B-celler ved baseline for det meste er placeret i det intravaskulære rum, klæbet til endotelet (>95% af murine hjerte B-celler viste sig at være placeret i det intravaskulære rum). Disse B-celler viste sig at have genekspressionsmønstre, der adskiller sig fra cirkulerende B-celler isoleret fra det perifere blod. Analyse af naive hjerter fra dyr uden B-celler og syngeneiske kontroller viste, at dyr, der manglede B-celler, havde mindre hjerter og højere udstødningsfraktion6. Alt dette tyder på, at B-celler kan modulere myokardievækst og / eller myokardiefunktion, og at ikke kun interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for sådanne observationer. B-celler viste sig også at modulere fænotypen af myokardieresidente makrofager8.
Flere undersøgelser har vist, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardietilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjerte, sandsynligvis gennem en CXCL13-CXCR5-afhængig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer, der inkluderer cytokinmedieret monocytrekruttering 9,12. Derudover kan B-celler producere antistoffer mod hjerteproteiner, der kan fremme udvidelsen af hjerteskader og negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også udøve beskyttende virkninger på det skadede hjerte gennem udskillelsen af IL-1010.
Efterhånden som antallet af grupper, der undersøger B-cellernes rolle i det naive og skadede hjerte, vokser, bliver det mere og mere vigtigt at definere fælles protokoller for korrekt at kvantificere og vurdere myokardie-B-celler og dermed undgå uoverensstemmelser, der allerede er begyndt at dukke op i litteraturen. Indtil videre er B-celler faktisk både rapporteret at være en af de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet7 og at være til stede med en markant lavere forekomst end myeloide celler 26,27 eller at være ret sjældne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade 7,9,13, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardium29. Undersøgelser af hjerteimmunceller giver sjældent detaljer om perfusionsbetingelser, og der er ingen konsensus om fordøjelsesbetingelserne. Da en stor del af B-cellerne i gnaverhjertet er intravaskulære, og ekstraktion af immunceller fra myokardiet er stærkt afhængig af den anvendte fordøjelsesmetode, kan de forskelle, der rapporteres i litteraturen, være resultatet af forskelle i organperfusion og vævsfordøjelse.
Præsenteret her er en detaljeret metode til flowcytometribaseret kvantificering af murinmyokardie B-celler, der maksimerer udbyttet af B-cellegendannelse ved at optimere perfusions- og fordøjelsesbetingelser og tillader diskrimination af intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler6. Denne protokol er en tilpasning og optimering af andre lignende protokoller, der skelner mellem intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.
I denne protokol standardiserer vi myokardieperfusion for at eliminere B-celler, der flyder i det intravaskulære rum uden at fjerne biologisk relevante B-celler, der klæber til det mikrovaskulære endotel. Ved at bygge videre på tidligere protokoller, der har beskrevet brugen af intravenøs injektion af antistoffer til at skelne intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og drage fordel af det faktum, at B-celler udtrykker overflademarkøren B22033, demonstrerer vi, hvordan man skelner mellem intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardie-B-celler gennem intravaskulær injektion af et B220-specifikt antistof umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusion. Denne protokol er relevant for forskningen fra enhver videnskabsmand, der er interesseret i at inkludere analysen af myokardiale B-celler i det naive og skadede hjerte. Den udbredte implementering af denne protokol vil reducere uoverensstemmelser mellem forskergrupper, vil muliggøre analyse af ændringer i de intravaskulære og ekstravaskulære myokardie-B-cellepuljer og dermed styrke udviklingen af opdagelser inden for hjerteimmunologi.
Sammenfattende repræsenterer protokollen en optimeret arbejdsgang til at kvantificere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri og samtidig skelne mellem celler placeret i det ekstravaskulære rum og det intravaskulære rum.
En voksende mængde beviser indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardieombygning / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et fremragende værktøj til at studere immuncellepopulatione…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af NHLBI-tilskud 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer, der blev brugt til at udvikle denne undersøgelse, blev finansieret af NIH Grant S10OD026859. Vi anerkender støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
R 4.1.1 | The R Foundation | ||
Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |