Summary

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.

Abstract

DNA-reparatie in de context van chromatine is slecht begrepen. Biochemische studies met nucleosoomkerndeeltjes, de fundamentele herhalende eenheid van chromatine, tonen aan dat de meeste DNA-reparatie-enzymen DNA-schade verwijderen met verminderde snelheden in vergelijking met vrij DNA. De moleculaire details over hoe base excision repair (BER) enzymen DNA-schade in nucleosomen herkennen en verwijderen, zijn niet opgehelderd. Biochemische BER-gegevens van nucleosomale substraten suggereren echter dat het nucleosoom verschillende structurele barrières vertoont, afhankelijk van de locatie van de DNA-laesie en het enzym. Dit geeft aan dat de mechanismen die door deze enzymen worden gebruikt om DNA-schade in vrij DNA te verwijderen, anders kunnen zijn dan die welke in nucleosomen worden gebruikt. Aangezien het grootste deel van het genomische DNA is geassembleerd tot nucleosomen, is structurele informatie van deze complexen nodig. Tot op heden ontbreekt het de wetenschappelijke gemeenschap aan gedetailleerde protocollen om technisch haalbare structurele studies van deze complexen uit te voeren. Hier bieden we twee methoden om een complex van twee genetisch gefuseerde BER-enzymen (Polymerase β en AP Endonuclease1) te bereiden die gebonden zijn aan een single-nucleotide-gap nabij de entry-exit van het nucleosoom voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structurele bepaling. Beide methoden voor monstervoorbereiding zijn compatibel voor het vitrificeren van kwaliteitsroosters via ondervriezen. Dit protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt om andere nucleosomale complexen te bereiden met verschillende BER-factoren, pioniertranscriptiefactoren en chromatine-modificerende enzymen.

Introduction

Eukaryote DNA wordt georganiseerd en verdicht door histoneiwitten, die chromatine vormen. Het nucleosoomkerndeeltje (NCP) vormt de fundamentele herhalende eenheid van chromatine die de toegankelijkheid tot DNA-bindende eiwitten reguleert voor DNA-reparatie, transcriptie en replicatie1. Hoewel de eerste röntgenkristalstructuur van het NCP meer dan twee decennia geleden voor het eerst werd opgelost2 en er sinds 3,4,5,6 nog veel meer structuren van het NCP zijn gepubliceerd, zijn DNA-reparatiemechanismen in nucleosomale substraten nog niet afgebakend. Het blootleggen van de moleculaire details die ten grondslag liggen aan DNA-reparatie in chromatine vereist structurele karakterisering van de deelnemende componenten om te begrijpen hoe lokale structurele kenmerken van het NCP DNA-reparatieactiviteiten reguleren. Dit is met name belangrijk in de context van base-excisieherstel (BER), aangezien biochemische studies met BER-enzymen unieke DNA-reparatiemechanismen in nucleosomen suggereren die afhankelijk zijn van enzymspecifieke structurele vereisten voor katalyse en de structurele positie van de DNA-laesie binnen het nucleosoom 7,8,9,10,11,12,13 . Aangezien BER een essentieel DNA-reparatieproces is, is er veel belangstelling om deze lacunes op te vullen en tegelijkertijd een startpunt vast te stellen van waaruit andere technisch haalbare structurele studies met relevante nucleosomale complexen kunnen worden uitgevoerd.

Cryo-EM wordt snel de voorkeursmethode voor het oplossen van de driedimensionale (3D) structuur van complexen waarvan de grootschalige voorbereiding van homogene monsters een uitdaging is. Hoewel het ontwerp en de zuivering van NCP’s gecomplexeerd met een DNA-reparatiefactor (NCP-DRF) waarschijnlijk op maat gemaakte optimalisatie vereist, biedt de hier gepresenteerde procedure om een stabiel NCP-DRF-complex te genereren en te bevriezen details over hoe het monster en de cryo-EM-netwerkvoorbereiding kunnen worden geoptimaliseerd. Twee workflows (die elkaar niet uitsluiten) in figuur 1 en de specifieke details in het protocol identificeren kritieke stappen en bieden strategieën voor het optimaliseren van deze stappen. Dit werk zal het chromatine- en DNA-reparatieveld voortstuwen in een richting waarin het aanvullen van biochemische met structurele studies technisch haalbaar wordt om de moleculaire mechanismen van nucleosomaal DNA-herstel beter te begrijpen.

Protocol

1. Assembleer nucleosoomkerndeeltjes via zout-gariëntdialyse OPMERKING: De bereiding van nucleosoomkerndeeltjes met behulp van recombinante histoneiwitten voor structurele studies is uitgebreid in detail beschreven door anderen14,15,16. Volg de zuivering van recombinant X. laevis histonen en histon octameer assemblage beschreven door anderen14,15,<…

Representative Results

Goed geassembleerde NCP’s (figuur 2) werden gebruikt om een complex te maken met een recombinant fusie-eiwit van MBP-Polβ-APE1 (figuur 3). Om de verhouding van NCP tot MBP-Polβ-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, voerden we elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests (EMSA) uit (figuur 4), die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met 5-voudige molaire overmaat van MBP-Polβ-APE1. Tijdens de optimal…

Discussion

Een specifiek protocol voor het zuiveren van de DNA-reparatiefactor zal afhankelijk zijn van het enzym van belang. Er zijn echter enkele algemene aanbevelingen, waaronder het gebruik van recombinante methoden voor eiwitexpressie en -zuivering18; als het eiwit van belang te klein is (<50 kDa), was structuurbepaling door cryo-EM tot voor kort bijna onmogelijk door het gebruik van fusiesystemen19, nanobody-bindende steigers20 en het optimaliseren van be…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Dr. Mario Borgnia van de cryo-EM-kern van het National Institute of Environmental Health Sciences en Dr. Joshua Strauss van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill voor hun mentorschap en training in de cryo-EM-netwerkvoorbereiding. We danken ook Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende voor de technische assistentie in de beginfase van dit project. We waarderen de belangrijke bijdrage en steun van wijlen Dr. Samuel H. Wilson en zijn laboratoriumleden, in het bijzonder Dr. Rajendra Prasad en Dr. Joonas Jamsen voor de zuivering van het genetisch gefuseerde APE1-Polβ-complex. Onderzoek is ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [subsidienummers Z01ES050158, Z01ES050159 en K99ES031662-01].

Materials

1 M HEPES; pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15630080
1 M MgCl2 Thermo Fisher Scientific AM9530G
10x TBE Bio-rad 1610733
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
3 M KCl Thermo Fisher Scientific 043398.K2
491 prep cell Bio-rad 1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma UFC8030
AutoGrid Tweezers Ted Pella 47000-600
Automatic Plunge Freezer Leica Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler Bio-rad 1851148
C-clips and rings Thermo Fisher 6640–6640
Clipping station SubAngostrom SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) Fisher Scientific 15370752
Diamond Tweezers Techni-Pro 758TW0010
dsDNA Integrated DNA techonologies N/A
FEI Titan Krios Thermo Fisher KRIOSG4TEM
FPLC purification system AKTA Pure 29018224
Fraction collector Model 2110 Bio-rad 7318122
Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S
Grid Boxes SubAngostrom PB-E
Grid Storage Accessory Pack SubAngostrom GSAX
Liquid Ethane N/A N/A
Liquid Nitrogen N/A N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump Gilson F155008
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels Thermo Fisher Scientific EC6695BOX
Pipetman Gilson FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention VWR 76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1) Bio-rad 1610158
polyethylene glycol (PEG) Millipore Sigma P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500 Millipore Sigma PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor N/A N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids Quantifoil N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer N/A N/A
Spring clipping tools SubAngostrom CSA-01
Superdex 200 column 10/300 Millipore Sigma GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope Thermo Fisher Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I Ted Pella 47000-500
UltraPure Glycerol Thermo Fisher Scientific 15514011
Vitrobot Thermo Fisher Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM) Cytiva 1005-055
Xylene cyanol Thermo Fisher Scientific 440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL Thermo Fisher Scientific 89877

Referenzen

  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemie. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Rodriguez, Y., Butay, K. J., Sharma, K., Viverette, E., Wilson, S. H. Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination. J. Vis. Exp. (186), e64061, doi:10.3791/64061 (2022).

View Video