Preparación de partículas de núcleo de nucleosomas complejadas con factores de reparación de ADN para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica
Summary
Este protocolo describe en detalle la preparación de complejos nucleosómicos utilizando dos métodos de preparación de muestras para congelar rejillas TEM.
Abstract
La reparación del ADN en el contexto de la cromatina es poco conocida. Los estudios bioquímicos que utilizan partículas de núcleo de nucleosomas, la unidad de repetición fundamental de la cromatina, muestran que la mayoría de las enzimas de reparación del ADN eliminan el daño del ADN a tasas reducidas en comparación con el ADN libre. Los detalles moleculares sobre cómo las enzimas de reparación por escisión de bases (BER) reconocen y eliminan el daño del ADN en los nucleosomas no se han dilucidado. Sin embargo, los datos bioquímicos de BER de sustratos nucleosómicos sugieren que el nucleosoma presenta diferentes barreras estructurales dependiendo de la ubicación de la lesión de ADN y la enzima. Esto indica que los mecanismos empleados por estas enzimas para eliminar el daño del ADN en el ADN libre pueden ser diferentes a los empleados en los nucleosomas. Dado que la mayoría del ADN genómico se ensambla en nucleosomas, se necesita información estructural de estos complejos. Hasta la fecha, la comunidad científica carece de protocolos detallados para realizar estudios estructurales técnicamente viables de estos complejos. Aquí, proporcionamos dos métodos para preparar un complejo de dos enzimas BER genéticamente fusionadas (polimerasa β y endonucleasa AP1) unidas a un espacio de un solo nucleótido cerca de la entrada-salida del nucleosoma para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica (crio-EM). Ambos métodos de preparación de muestras son compatibles para vitrificar rejillas de calidad mediante congelación por inmersión. Este protocolo se puede utilizar como punto de partida para preparar otros complejos nucleosómicos con diferentes factores BER, factores de transcripción pioneros y enzimas modificadoras de la cromatina.
Introduction
El ADN eucariota es organizado y compactado por proteínas histonas, formando cromatina. La partícula del núcleo del nucleosoma (NCP) constituye la unidad de repetición fundamental de la cromatina que regula la accesibilidad a las proteínas de unión al ADN para la reparación, transcripción y replicación del ADN1. Aunque la primera estructura cristalina de rayos X del NCP se resolvió por primera vez hace más de dos décadas2 y se han publicado muchas más estructuras del NCPdesde 3,4,5,6, los mecanismos de reparación del ADN en sustratos nucleosómicos aún no se han delineado. Descubrir los detalles moleculares subyacentes a la reparación del ADN en la cromatina requerirá la caracterización estructural de los componentes participantes para comprender cómo las características estructurales locales del NCP regulan las actividades de reparación del ADN. Esto es particularmente importante en el contexto de la reparación por escisión de bases (BER) dado que los estudios bioquímicos con enzimas BER sugieren mecanismos únicos de reparación del ADN en nucleosomas que dependen de los requisitos estructurales específicos de la enzima para la catálisis y la posición estructural de la lesión del ADN dentro del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dado que el BER es un proceso vital de reparación del ADN, existe un interés considerable en llenar estos vacíos y al mismo tiempo establecer un punto de partida desde el cual se puedan llevar a cabo otros estudios estructurales técnicamente factibles que involucren complejos nucleosómicos relevantes.
Cryo-EM se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para resolver la estructura tridimensional (3D) de complejos cuya preparación a gran escala de muestras homogéneas es un desafío. Aunque el diseño y la purificación de NCP complejados con un factor de reparación del ADN (NCP-DRF) probablemente requerirán una optimización personalizada, el procedimiento presentado aquí para generar y congelar un complejo NCP-DRF estable proporciona detalles sobre cómo optimizar la preparación de la rejilla crio-EM y de la muestra. Dos flujos de trabajo (no mutuamente excluyentes) que se muestran en la figura 1 y los detalles específicos del protocolo identifican los pasos críticos y proporcionan estrategias para optimizarlos. Este trabajo impulsará el campo de la cromatina y la reparación del ADN en una dirección en la que complementar los estudios bioquímicos con estudios estructurales sea técnicamente factible para comprender mejor los mecanismos moleculares de la reparación del ADN nucleosómico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocolo específico para purificar el factor de reparación del ADN dependerá de la enzima de interés. Sin embargo, hay algunas recomendaciones generales, incluyendo el uso de métodos recombinantes para la expresión y purificación de proteínas18; si la proteína de interés es demasiado pequeña (<50 kDa), la determinación de la estructura por crio-EM había sido casi imposible hasta más recientemente mediante el uso de sistemas de fusión19, andamios de unión…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Mario Borgnia del núcleo crio-EM en el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental y al Dr. Joshua Strauss de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill por su tutoría y capacitación en la preparación de la red crio-EM. Juliana Mello Da Fonseca Rezende por su asistencia técnica en las etapas iniciales de este proyecto. Apreciamos la contribución clave y el apoyo del difunto Dr. Samuel H. Wilson y sus miembros de laboratorio, especialmente el Dr. Rajendra Prasad y el Dr. Joonas Jamsen para la purificación del complejo APE1-Polβ genéticamente fusionado. La investigación ha sido apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [números de subvención Z01ES050158, Z01ES050159 y K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
Referenzen
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