Summary

El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

El agotamiento extracelular de la glucosa marcada fluorescentemente se correlaciona con la absorción de glucosa y podría usarse para la detección de alto rendimiento de la absorción de glucosa en órganos extirpados y cultivos celulares.

Abstract

La epidemia mundial de diabetes en curso aumenta la demanda de identificación de factores ambientales, nutricionales, endocrinos, genéticos y epigenéticos que afectan la absorción de glucosa. La medición de la fluorescencia intracelular es un método ampliamente utilizado para probar la absorción de glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) en células in vitro, o para obtener imágenes de tejidos que consumen glucosa in vivo. Este ensayo evalúa la absorción de glucosa en un punto de tiempo elegido. El análisis intracelular asume que el metabolismo de la glucosa DF es más lento que el de la glucosa endógena, que participa en las reacciones catabólicas y anabólicas y en la señalización. Sin embargo, el metabolismo dinámico de la glucosa también altera los mecanismos de absorción, lo que requeriría mediciones cinéticas de la absorción de glucosa en respuesta a diferentes factores. Este artículo describe un método para medir el agotamiento extracelular de la DF-glucosa y valida su correlación con la absorción intracelular de FD-glucosa en células y tejidos ex vivo. El agotamiento extracelular de la glucosa puede ser potencialmente aplicable para estudios cinéticos y dependientes de la dosis de alto rendimiento, así como para identificar compuestos con actividad glucémica y sus efectos específicos del tejido.

Introduction

La demanda para medir la absorción de glucosa aumenta junto con la necesidad crítica de abordar un aumento epidémico en una multitud de enfermedades dependientes del metabolismo de la glucosa. Los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas degenerativas, los trastornos neurológicos y cognitivos1, las enfermedades inflamatorias2 e infecciosas3, el cáncer 4,5, así como el envejecimiento6, dependen del metabolismo de la glucosa para obtener energía y su almacenamiento, los procesos anabólicos, la modificación de proteínas y genes, la señalización, la regulación de genes y la síntesis y replicación de ácidos nucleicos 7,8,9 . La diabetes mellitus (DM) está directamente relacionada con el mal funcionamiento de la regulación de la absorción de glucosa. La DM es un espectro de enfermedades crónicas como la diabetes mellitus tipo 1, -2 y -3, la diabetes gestacional, la diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes y otros tipos de esta enfermedad inducida por factores ambientales y / o genéticos. En 2016, el primer informe mundial de la OMS sobre la diabetes demostró que el número de adultos que viven con la DM más extendida casi se ha cuadruplicado desde 1980 a 422 millones de adultos10, y este número de pacientes con DM ha aumentado exponencialmente durante las últimas décadas. Solo en 2019, una estimación de 1,5 millones de muertes fue causada directamente por DM10. Este aumento dramático se debe al aumento de la DM tipo 2 y las condiciones que la impulsan, incluido el sobrepeso y la obesidad10. La pandemia de COVID-19 reveló un aumento de dos veces en la mortalidad en pacientes con DM en comparación con la población general, lo que sugiere el papel profundo pero poco conocido del metabolismo de la glucosa en la defensa inmune3. La prevención, el diagnóstico temprano y el tratamiento de la DM, la obesidad y otras enfermedades requieren la optimización de las mediciones de la absorción de glucosa por diferentes tejidos y la identificación de los factores ambientales11,nutricionales 12, endocrinos 13,genéticos 14 y epigenéticos15 que afectan la absorción de glucosa.

En la investigación, la absorción intracelular y/o tisular de glucosa se mide comúnmente mediante glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) in vitro 16,17,18 e in vivo19. La glucosa FD se convirtió en un método preferido en comparación con los métodos más precisos que utilizan glucosa20 marcada radiactivamente, análisis analítico de espectroscopiade masas 21, metabolómica22, métodos de resonancia magnética nuclear23 y tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT)5,24. A diferencia de la absorción de glucosa FD, los métodos analíticos que requieren más material biológico pueden implicar una preparación de muestras de varios pasos, instrumentos costosos y análisis de datos complejos. Las mediciones efectivas y económicas de la absorción de glucosa FD en cultivos celulares se han utilizado en experimentos de prueba de concepto y pueden requerir la validación por otros métodos.

La base de la aplicación de DF-glucosa para los estudios de captación de glucosa es la reducción del metabolismo de la glucosa-DF en comparación con la glucosa endógena25. Sin embargo, tanto la glucosa endógena como la glucosa FD se distribuyen dinámicamente entre todos los compartimentos celulares para su uso en procesos anabólicos, catabólicos y de señalización. La compartimentación y el procesamiento dependiente del tiempo25 de la glucosa FD interfieren con las mediciones de fluorescencia y representan los principales factores limitantes para el uso de este ensayo en experimentos de detección de alto rendimiento, análisis cinético, cultivo celular 3D, cocultivos y experimentos de explante de tejidos. Aquí, proporcionamos datos que demuestran una alta correlación entre el agotamiento extracelular de la glucosa FD y su absorción intracelular, lo que sugiere el agotamiento extracelular de la glucosa FD como una medida sustituta para la absorción de glucosa intracelular. La medición del agotamiento extracelular de la glucosa se aplicó para validar las diferencias específicas del tejido en la absorción de glucosa en ratones tratados con insulina y un fármaco experimental18 para proporcionar una prueba de principio de este método.

El protocolo actual describe mediciones intracelulares y extracelulares (Figura 1) de la absorción de glucosa FD en células 3T3-L1. Las secciones 1-7 del protocolo explican el cultivo y el crecimiento de las células durante 48 h; inanición celular, estimulación y mediciones extracelulares basales; y mediciones posteriores a la estimulación de la FD-glucosa extracelular y mediciones intracelulares de la FD-glucosa y la proteína. La sección 8 del protocolo describe la medición ex vivo de la captación extracelular de FD-glucosa en tejidos diseccionados de ratones ob/ob en presencia y ausencia de insulina y compuesto de aminoácidos 2 (AAC2) descrita en otra parte18.

Protocol

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4). NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II con el soplador encendido y las luces apagadas. 1. Preparación de materiales NOTA: Todos los materiales se enumeran en la Tabla de materiales. <l…

Representative Results

La ingesta intracelular y el agotamiento extracelular de glucosa se midieron en preadipocitos 3T3-L1, en respuesta a diferentes concentraciones de DF-glucosa (Figura 2) con y sin estimulación con insulina. La Figura 2A demuestra un aumento dependiente de la dosis en la absorción intracelular de FD-glucosa, que aumentó significativamente en presencia de insulina. La disminución concomitante de la glucosa FD extracelular en las mismas células se muestra en la…

Discussion

La comparación directa del agotamiento extracelular de la glucosa FD con la absorción normalizada de glucosa intracelular en el cultivo celular mostró una alta correlación, lo que sugiere que el agotamiento extracelular de la glucosa podría ser una medida sustituta para la evaluación de la absorción de glucosa. La medición de la glucosa FD extracelular puede utilizar una amplia gama de concentraciones de glucosa FD, también 0.5-2.5 μg FD-glucosa / ml parecen proporcionar el rango óptimo. La FD-glucosa extracel…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El proyecto fue apoyado por Ralph y Marian Falk Medical Research Catalyst Award y Kathleen Kelly Award. Otros apoyos incluyeron el Centro Nacional de Recursos de Investigación UL1RR025755 y NCI P30CA16058 (OSUCCC), la Hoja de ruta de los NIH para la investigación médica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa los puntos de vista oficiales del Centro Nacional de Recursos de Investigación o los NIH.

Materials

3T3-L1 mouse fibroblasts ATCC CL-173 Cell line
96-well plates Falcon 353227 Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice Jackson Laboratory stock number 000632 Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) Fisher Scientific, US  B-SHT Device
Bovine serum Gibco/ThermoFisher 161790-060 Cell culture
Calf serum Gibco/ThermoFisher 26010-066 Cell culture
Cell incubator Forma Series II Water Jacket Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated) Envigo Teklad LM-485 Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma LifeScience D2650-100mL Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco/ThermoFisher  11965-092 Cell culture
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500mL Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) Sigma 72987-1MG Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM Gibco/ThermoFisher A14430-01 Cell culture
Human insulin 10 mg/mL MilliporeSigma, Cat N 91077C Cat N 91077C Reagent
Isoflurane, 5% Henry Schein NDC 11695-6776-2 Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco/ThermoFisher 15140-122 Cell culture
Phosphate buffered solution Sigma-Aldrich DA537-500 mL Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay ThermoFisher Cat N23225 Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer Santa Cruz Biotechnology sc-24948 Assay
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco/ThermoFisher  25300-054 Cell culture

Referenzen

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

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Diesen Artikel zitieren
Kumar, S. B., Arnipalli, S., Abushukur, A., Carrau, S., Mehta, P., Ziouzenkova, O. Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo. J. Vis. Exp. (182), e63681, doi:10.3791/63681 (2022).

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