Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

Die Nachfrage nach der Messung der Glukoseaufnahme steigt zusammen mit der dringenden Notwendigkeit, einen epidemischen Anstieg einer Vielzahl von Krankheiten, die vom Glukosestoffwechsel abhängen, anzugehen. Zugrunde liegende Mechanismen von degenerativen Stoffwechselerkrankungen, neurologischen und kognitiven Störungen¹, entzündlichen 2 und Infektionskrankheiten³, Krebs^4,5 sowie Alterung⁶, hängen vom Glukosestoffwechsel für Energie und deren Speicherung, anabole Prozesse, Protein- und Genmodifikation, Signalisierung, Regulation von Genen und Nukleinsäuresynthese und Replikation ab ^7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) steht in direktem Zusammenhang mit einer Fehlfunktion der Regulation der Glukoseaufnahme. DM ist ein Spektrum chronischer Krankheiten wie Typ-1-, -2- und -3-Diabetes mellitus, Schwangerschaftsdiabetes, Altersdiabetes der Jungen und andere Arten dieser Krankheit, die durch Umwelt- und / oder genetische Faktoren induziert werden. Im Jahr 2016 zeigte der erste globale Bericht der WHO über Diabetes, dass sich die Zahl der Erwachsenen, die mit der am weitesten verbreiteten DM leben, seit 1980 auf 422 Millionen Erwachsene fast vervierfacht^{hat 10}, und diese Zahl der DM-Patienten ist in den letzten Jahrzehnten exponentiell gestiegen. Allein im Jahr 2019 wurden schätzungsweise^1,5 Millionen Todesfälle direkt durch 10 DM verursacht. Dieser dramatische Aufschwung ist auf den Anstieg der Typ-2-DM und die Bedingungen zurückzuführen, die sie antreiben, einschließlich Übergewicht und Fettleibigkeit¹⁰. Die COVID-19-Pandemie zeigte einen zweifachen Anstieg der Mortalität bei Patienten mit DM im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung, was auf die tiefgreifende, aber wenig verstandene Rolle des Glukosestoffwechsels bei der Immunabwehr^{hindeutet 3.} Prävention, Früherkennung und Behandlung von DM, Fettleibigkeit und anderen Krankheiten erfordern die Optimierung von Messungen der Glukoseaufnahme durch verschiedene Gewebe und die Identifizierung von Umweltfaktoren 11, Ernährung 12, endokrine¹³, genetische¹⁴ und epigenetische ^15, die die Glukoseaufnahme beeinflussen.

In der Forschung wird die intrazelluläre und/oder Gewebeaufnahme von Glukose üblicherweise durch fluoreszenzmarkierte Glukose (FD-Glukose) in vitro 16,17,18 und in vivo ¹⁹ gemessen^. FD-Glucose wurde zu einer bevorzugten Methode im Vergleich zu präziseren Methoden mit radioaktiv markierter Glukose 20, analytischer Massenspektroskopieanalyse 21, Metabolomik 22, Kernspinresonanzmethoden 23 und Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)^5,24. Im Gegensatz zur Aufnahme von FD-Glukose können analytische Methoden, die mehr biologisches Material erfordern, eine mehrstufige Probenvorbereitung, teure Instrumente und komplexe Datenanalysen umfassen. Effektive und kostengünstige Messungen der FD-Glukoseaufnahme in Zellkulturen wurden in Proof-of-Concept-Experimenten verwendet und erfordern möglicherweise eine Validierung durch andere Methoden.

Die Grundlage der FD-Glukoseanwendung für Glukoseaufnahmestudien ist der reduzierte Metabolismus von FD-Glukose im Vergleich zu endogener Glukose²⁵. Nichtsdestotrotz sind sowohl endogene Glukose als auch FD-Glukose dynamisch auf alle zellulären Kompartimente verteilt, um sie in anabolen, katabolen und Signalprozessen einzusetzen. Die Kompartimentierung und zeitabhängige Verarbeitung²⁵ von FD-Glucose stören die Fluoreszenzmessungen und stellen die wichtigsten limitierenden Faktoren für die Verwendung dieses Assays in Hochdurchsatz-Screening-Experimenten, kinetischen Analysen, 3D-Zellkulturen, Co-Kulturen und Gewebeexplantationsexperimenten dar. Hier liefern wir Daten, die eine hohe Korrelation zwischen dem extrazellulären Abbau von FD-Glukose und seiner intrazellulären Aufnahme zeigen, was auf den extrazellulären Abbau von FD-Glucose als Ersatzmessung für die intrazelluläre Glukoseaufnahme hindeutet. Die Messung des extrazellulären Erschöpfungs von Glukose wurde angewendet, um gewebespezifische Unterschiede in der Glukoseaufnahme bei Mäusen, die mit Insulin behandelt wurden, und einem experimentellen Medikament¹⁸ zu validieren, um einen Proof-of-Principle dieser Methode zu liefern.

Das aktuelle Protokoll beschreibt intrazelluläre und extrazelluläre (Abbildung 1) Messungen der FD-Glukoseaufnahme in 3T3-L1-Zellen. Protokollabschnitte 1-7 erklären die Kultur und das Wachstum von Zellen für 48 h; Zellhunger, Stimulation und extrazelluläre Basismessungen; und Poststimulationsmessungen von extrazellulärer FD-Glucose und intrazellulären Messungen von FD-Glucose und Protein. Protokollabschnitt 8 beschreibt die Ex-vivo-Messung der extrazellulären Aufnahme von FD-Glucose in Geweben, die von ob /ob-Mäusen in Gegenwart und Abwesenheit von Insulin und Aminosäureverbindung 2 (AAC2) seziert wurden, wie an anderer Stelle¹⁸ beschrieben.