Summary

Terapia fotodinamica mediata dal Bengala Rosa per inibire la Candida albicans

Published: March 24, 2022
doi:

Summary

La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l’efficacia dell’aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.

Abstract

L’infezione invasiva da Candida albicans è una significativa infezione fungina opportunistica negli esseri umani perché è uno dei colonizzatori più comuni dell’intestino, della bocca, della vagina e della pelle. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, il tasso di mortalità della candidosi invasiva rimane ~ 50%. Sfortunatamente, l’incidenza di C. albicans resistente ai farmaci sta aumentando a livello globale. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire un trattamento alternativo o adiuvante per inibire la formazione di biofilm di C. albicans e superare la resistenza ai farmaci. L’aPDT mediato da Rose Bengal (RB) ha dimostrato un’efficace uccisione cellulare di batteri e C. albicans. In questo studio, viene descritta l’efficacia di RB-aPDT su C. albicans multiresistente ai farmaci. Una sorgente luminosa a diodi a emissione di luce verde (LED) fatta in casa è progettata per allinearsi con il centro di un pozzo di una piastra a 96 pozzetti. I lieviti sono stati incubati nei pozzetti con diverse concentrazioni di RB e illuminati con fluenze variabili di luce verde. Gli effetti di uccisione sono stati analizzati con il metodo di diluizione della piastra. Con una combinazione ottimale di luce e RB, è stata raggiunta l’inibizione della crescita a 3 log. Si è concluso che RB-aPDT potrebbe potenzialmente inibire C. albicans resistente ai farmaci.

Introduction

C. albicans colonizza nel tratto gastrointestinale e genito-urinario di individui sani e può essere rilevato come microbiota normale in circa il 50% degli individui1. Se si crea uno squilibrio tra l’ospite e l’agente patogeno, C. albicans è in grado di invadere e causare malattie. L’infezione può variare da infezioni locali della mucosa a insufficienza multiorgano2. In uno studio di sorveglianza multicentrico negli Stati Uniti, circa la metà degli isolati di pazienti con candidosi invasiva tra il 2009 e il 2017 è C. albicans3. La candidemia può essere associata ad alti tassi di morbilità, mortalità, degenza ospedaliera prolungata4. I Centri statunitensi di controllo e prevenzione delle malattie hanno riferito che circa il 7% di tutti i campioni di sangue di Candida testati sono resistenti al farmaco antifungino fluconazolo5. L’emergere di specie di Candida resistenti ai farmaci solleva la preoccupazione di sviluppare una terapia alternativa o adiuvante agli agenti antimicotici.

La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prevede l’attivazione di un fotosensibilizzante specifico (PS) con la luce alla lunghezza d’onda di assorbimento di picco del PS6. Dopo l’eccitazione, il PS eccitato trasferisce la sua energia o elettroni alle molecole di ossigeno vicine e ritorna allo stato fondamentale. Durante questo processo, si formano specie reattive dell’ossigeno e ossigeno singoletto che causano danni alle cellule. aPDT è stato ampiamente utilizzato per uccidere i microrganismi dal 19907. Uno dei vantaggi dell’aPDT è che più organelli sono danneggiati in una cellula dall’ossigeno singoletto e / o dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS) durante l’irradiazione; pertanto, la resistenza all’aPDT non è stata trovata fino ad oggi. Inoltre, un recente studio ha riportato che i batteri sopravvissuti dopo l’aPDT sono diventati più sensibili agli antibiotici8.

Le sorgenti luminose utilizzate in aPDT includono laser, lampade alogene metalliche con filtri, luce nel vicino infrarosso e diodi emettitori di luce (LED)9,10,11,12. Il laser fornisce un’elevata potenza luminosa, solitamente superiore a 0,5 W/cm2, che consente l’erogazione di una dose di luce elevata in un tempo molto breve. È stato ampiamente utilizzato nei casi in cui un tempo di trattamento più lungo è scomodo come aPDT per le infezioni orali. Lo svantaggio di un laser è che la sua dimensione spot di illuminazione è piccola, che va da poche centinaia di micrometri a 10 mm con un diffusore. Inoltre, le apparecchiature laser sono costose e richiedono una formazione specifica per funzionare. D’altra parte, l’area di irradiazione di una lampada alogena metallica con filtri è relativamente più grande13. Tuttavia, la lampada è troppo pesante e costosa. Le sorgenti luminose a LED sono diventate mainstream di aPDT in campo dermatologico perché è piccolo e meno costoso. L’area di irradiazione può essere relativamente grande con una disposizione array della lampadina a LED. L’intero viso può essere illuminato contemporaneamente9. Tuttavia, la maggior parte, se non tutte, le sorgenti luminose a LED disponibili oggi sono progettate per uso clinico. Potrebbe non essere adatto per esperimenti in un laboratorio perché occupa spazio e costoso. Abbiamo sviluppato un array di LED economico che è molto piccolo e può essere tagliato e assemblato da una striscia LED. I LED possono essere montati in diverse disposizioni per diversi progetti sperimentali. Diverse condizioni di aPDT possono essere completate in una piastra a 96 pozzetti o anche in una piastra a 384 pozzetti in un esperimento.

Rose bengal (RB) è un colorante colorato ampiamente utilizzato per migliorare la visualizzazione dei danni corneali negli occhi umani14. L’aPDT mediato da RB ha mostrato effetti di uccisione su Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans con un’efficienza approssimativamente paragonabile a quella del blu di Toluidina O15. Questo studio dimostra un metodo per convalidare l’effetto di RB-aPDT su C. albicans multiresistente.

Protocol

1. Preparazione del sistema aPDT Tagliare quattro diodi emettitori di luce verde (LED) da una striscia LED (vedere Tabella dei materiali) e allinearli con quattro pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (Figura 1).NOTA: i LED sono stati disposti in un array 4 x 3. Il retro del LED è stato fatto aderire a un dissipatore di calore per disperdere il calore durante l’irradiazione. Misurare la frequenza di fluenza11 …

Representative Results

La Figura 1 mostra il sistema aPDT utilizzato nel presente studio. Poiché le alte temperature possono causare una significativa morte cellulare, l’array di LED viene raffreddato da una ventola elettrica e un dissipatore di calore viene utilizzato durante l’irradiazione per mantenere una temperatura costante a 25 ± 1 °C. L’effetto calore può essere scontato. Avere una distribuzione uniforme della luce è anche un importante fattore determinante per un aPDT di successo; pertanto, è fonda…

Discussion

Risultati incoraggianti delle applicazioni cliniche di RB-PDT per la cheratite fungina sono stati riportati di recente19. Il picco di assorbimento di RB è a 450-650 nm. È essenziale determinare la frequenza di fluenza della sorgente luminosa per un aPDT di successo. Una fluenza elevata (di solito >100 J / cm2) è necessaria per trattare le cellule tumorali, mentre una fluenza inferiore dovrebbe trattare le lesioni infette6. Un’elevata fluenza significa un lungo…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Center of Applied Nanomedicine, dalla National Cheng Kung University dal Featured Areas Research Center Program nell’ambito del Higher Education Sprout Project dal Ministero dell’Istruzione (MOE) e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] a TW Wong. J.H. Hung riconosce i finanziamenti del National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018] e [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

Materials

1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Falcon, USA #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Aluminum foil sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan BK-T220-0051-01
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R disperses heat from the LED array
Graph pad prism software GraphPad 8.0, San Diego, California, USA graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan 2835
Incubator Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R) Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Light power meter Ophir, Jerusalem, Israel PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter Merck, NJ, USA SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan BCRC 21538/ATCC 10231 http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, MO, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

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Diesen Artikel zitieren
Hung, J., Wang, Z., Lo, Y., Lee, C., Chang, Y., Chang, R. Y., Huang, C., Wong, T. Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans. J. Vis. Exp. (181), e63558, doi:10.3791/63558 (2022).

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