Thérapie photodynamique médiée par rose Bengal pour inhiber Candida albicans
Summary
L’incidence croissante de Candida albicans résistant aux médicaments est un grave problème de santé dans le monde entier. La thérapie photodynamique antimicrobienne (TDA) peut offrir une stratégie pour lutter contre les infections fongiques résistantes aux médicaments. Le présent protocole décrit l’efficacité de l’aPDT médiée par rose bengal sur une souche multirésistante de C. albicans in vitro.
Abstract
L’infection invasive à Candida albicans est une infection fongique opportuniste importante chez l’homme, car c’est l’un des colonisateurs les plus courants de l’intestin, de la bouche, du vagin et de la peau. Malgré la disponibilité de médicaments antifongiques, le taux de mortalité de la candidose invasive reste d’environ 50%. Malheureusement, l’incidence de C. albicans pharmacorésistant augmente à l’échelle mondiale. La thérapie photodynamique antimicrobienne (TDA) peut offrir un traitement alternatif ou adjuvant pour inhiber la formation de biofilm de C. albicans et surmonter la résistance aux médicaments. L’aPDT médiée par le bengale rose (RB) a montré une destruction cellulaire efficace des bactéries et de C. albicans. Dans cette étude, l’efficacité de RB-aPDT sur C. albicans multirésistant est décrite. Une source lumineuse à diode électroluminescente verte (DEL) faite maison est conçue pour s’aligner avec le centre d’un puits d’une plaque de 96 puits. Les levures ont été incubées dans les puits avec différentes concentrations de RB et éclairées par des fluences variables de lumière verte. Les effets de destruction ont été analysés par la méthode de dilution des plaques. Avec une combinaison optimale de lumière et de RB, une inhibition de croissance de 3 log a été obtenue. Il a été conclu que RB-aPDT pourrait potentiellement inhiber C. albicans résistant aux médicaments.
Introduction
C. albicans colonise les voies gastro-intestinales et génito-urinaires des individus en bonne santé et peut être détecté comme un microbiote normal chez environ 50% des individus1. Si un déséquilibre est créé entre l’hôte et l’agent pathogène, C. albicans est capable d’envahir et de causer des maladies. L’infection peut aller d’infections locales des muqueuses à une défaillance de plusieurs organes2. Dans une étude de surveillance multicentrique aux États-Unis, environ la moitié des isolats de patients atteints de candidose invasive entre 2009 et 2017 sont C. albicans3. La candidémie peut être associée à des taux élevés de morbidité, de mortalité, de séjour prolongé à l’hôpital4. Les Centers of Disease Control and Prevention des États-Unis ont rapporté qu’environ 7% de tous les échantillons de sang de Candida testés sont résistants au médicament antifongique fluconazole5. L’émergence d’espèces de Candida résistantes aux médicaments soulève la préoccupation de développer un traitement alternatif ou adjuvant aux agents antimycotiques.
La thérapie photodynamique antimicrobienne (APDT) consiste à activer un photosensibilisateur (PS) spécifique avec de la lumière à la longueur d’onde d’absorption maximale du PS6. Après excitation, le PS excité transfère son énergie ou ses électrons aux molécules d’oxygène voisines et retourne à l’état fondamental. Au cours de ce processus, des espèces réactives de l’oxygène et de l’oxygène singulet se forment et causent des dommages cellulaires. l’aPDT est largement utilisé pour tuer les micro-organismes depuis les années 19907. L’un des avantages de l’aPDT est que plusieurs organites sont endommagés dans une cellule par l’oxygène singulet et / ou les espèces réactives de l’oxygène (ROS) pendant l’irradiation; ainsi, la résistance à l’aPDT n’a pas été trouvée jusqu’à aujourd’hui. De plus, une étude récente a rapporté que les bactéries qui ont survécu après une TPD sont devenues plus sensibles aux antibiotiques8.
Les sources lumineuses utilisées dans l’aPDT comprennent les lasers, les lampes halogènes métalliques avec filtres, la lumière proche infrarouge et les diodes électroluminescentes (LED)9,10,11,12. Le laser fournit une puissance lumineuse élevée, généralement supérieure à 0,5 W / cm2, qui permet de délivrer une dose de lumière élevée en très peu de temps. Il a été largement utilisé dans les cas où un temps de traitement plus long est gênant, comme l’aPDT pour les infections buccales. L’inconvénient d’un laser est que sa taille d’éclairage est petite, allant de quelques centaines de micromètres à 10 mm avec un diffuseur. De plus, l’équipement laser est coûteux et nécessite une formation spécifique pour fonctionner. D’autre part, la zone d’irradiation d’une lampe halogène métallique avec filtres est relativement plus grande13. Cependant, la lampe est trop lourde et chère. Les sources de lumière LED sont devenues courantes de l’aPDT dans le domaine dermatologique car elles sont petites et moins chères. La zone d’irradiation peut être relativement grande avec une disposition en réseau de l’ampoule LED. L’ensemble du visage peut être éclairé en même temps9. Néanmoins, la plupart, sinon la totalité, des sources lumineuses LED disponibles aujourd’hui sont conçues pour un usage clinique. Il peut ne pas convenir à des expériences en laboratoire car il occupe de l’espace et coûte cher. Nous avons développé un réseau de LED peu coûteux qui est très petit et peut être coupé et assemblé à partir d’une bande LED. Les LED peuvent être montées dans différents arrangements pour différentes conceptions expérimentales. Différentes conditions d’aPDT peuvent être complétées dans une plaque de 96 puits ou même une plaque de 384 puits en une seule expérience.
Rose bengal (RB) est un colorant coloré largement utilisé pour améliorer la visualisation des dommages cornéens dans les yeux humains14. L’aPDT médiée par RB a montré des effets meurtriers sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli et C. albicans avec une efficacité à peu près comparable à celle du bleu de toluidine O15. Cette étude démontre une méthode pour valider l’effet de RB-aPDT sur C. albicans multirésistant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des résultats encourageants des applications cliniques de rb-PDT pour la kératite fongique ont été rapportés récemment19. Le pic d’absorption de RB est de 450-650 nm. Il est essentiel de déterminer le taux de fluence de la source lumineuse pour une APDT réussie. Une fluence élevée (habituellement >100 J/cm2) est nécessaire pour traiter les cellules cancéreuses, tandis qu’une fluence plus faible devrait traiter les lésions infectées6. Une fluence…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a reçu un financement du Centre de nanomédecine appliquée de l’Université nationale Cheng Kung du programme du Centre de recherche Featured Areas dans le cadre du projet Higher Education Sprout du ministère de l’Éducation (MOE) et du ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan [MOST 109-2327-B-006-005] à TW Wong. J.H. Hung reconnaît le financement de l’hôpital universitaire national Cheng Kung, Taïwan [NCKUH-11006018], et [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
Referenzen
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