Ett protokoll som beskriver bildandet av humana blastoider som effektivt, i rätt tid och sekventiellt genererar blastocystliknande celler.
En modell av den mänskliga blastocysten bildad av stamceller (blastoid) skulle stödja vetenskapliga och medicinska framsteg. Dess prediktiva kraft kommer emellertid att bero på dess förmåga att effektivt, i rätt tid och troget rekapitulera sekvenserna för blastocystutveckling (morfogenes, specifikation, mönstring) och att bilda celler som återspeglar blastocyststadiet. Här visar vi att naiva mänskliga pluripotenta stamceller odlade under PXGL-förhållanden och sedan tredubbla hämmade för Hippo, transformerande tillväxtfaktor- β och extracellulära signalreglerade kinasvägar effektivt genomgår morfogenes för att bilda blastoider (>70%). Matchning med utvecklingstidpunkt (~ 4 dagar) rullar blastoider blastocystsekvensen av specifikationen genom att producera analoger av trofoblasten och epiblasten, följt av bildandet av analoger av den primitiva endodermen och de polära trofoblasterna. Detta resulterar i bildandet av celler som transkriptionellt liknar blastocysten (>96%) och en minoritet av postimplantationsanaloger. Blastoider mönstrar effektivt genom att bilda den embryonala-abemboroniska axeln som kännetecknas av mognaden av polarområdet (NR2F2+), som förvärvar den specifika potentialen att rikta till hormonellt stimulerade endometrieceller, som i livmodern. En sådan human blastoid är en skalbar, mångsidig och etisk modell för att studera mänsklig utveckling och implantation in vitro.
Brist på experimentella modeller har begränsat förståelsen för tidig mänsklig embryogenes. Aktuell kunskap om människospecifika aspekter av embryonal utveckling härrör från överskott av in vitro fertilisering (IVF) embryon donerade för forskning. Den begränsade tillgängligheten, svårigheterna med experimentella manipulationer och embryonas varierande kvalitet hindrar dock vetenskapliga undersökningar. Tvärtom skulle en trogen in vitro-modell av mänskliga embryon möjliggöra komplexa experimentella manipulationer och därmed ge en etisk möjlighet att komplettera forskningen på mänskliga embryon 1,2,3,4. En tidigare utvecklad modell av musblastocyster kombinerade musembryonala stamceller och trofoblaststamceller5. I detta detaljerade protokoll beskrivs en metod för att generera en modell av den mänskliga blastocysten från naiva pluripotenta stamceller som är trogen elementära blastocystkriterier6.
Fyra kriterier för humana blastoider. Här, i ett försök att upprätta en standardiserad definition av humana blastoider, föreslår vi fyra minimala kriterier. Även om de inte är uttömmande kan dessa kriterier tjäna som grund för att utvärdera de parametrar som möjliggör bildandet av humana blastoider (figur 1A). (1) Blastoider bör bildas effektivt när det gäller morfologi och generering av analogerna i de tre släktlinjerna, nämligen epiblast (Epi), trophectoderm (TE) och primitiv endoderm (PrE). Ineffektivitet kommer sannolikt att peka på ett otillräckligt initialt celltillstånd eller / och odlingstillstånd (t.ex. blastoidmedium). (2) Blastoider bör generera analoger av de tre släktlinjerna enligt utvecklingssekvensen (Epi/TE först, PrE/polarTE sist)7,8 och timing (induktion ~ 3 dagar; embryonala dagar 5-7)7,9. (3) Blastoider bör bilda analoger av blastocyststadiet, men inte av postimplantationsstadier (t.ex. epiblast efter implantation, trofoblast eller amnionceller). (4) Slutligen bör blastoider kunna rekapitulera funktionella egenskaper hos implantation och utveckling av blastocyster. Med hjälp av detta protokoll bildas humana blastoider effektivt med hjälp av flera cellinjer (>70%), kan generera blastocystcellanalogerna sekventiellt och inom 4 dagar, och analogerna liknar transkriptionellt blastocyststadiet (>96% baserat på flera analyser)6,10,11. Slutligen genererar blastoider robust den embryonala-abemboroniska axeln, vilket gör att de kan interagera med hormonellt stimulerade endometrieceller genom polarområdet och robust expandera linjerna vid utökad odling (tidsekvivalent: embryonal dag 13).
Betydelsen av det ursprungliga celltillståndet. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) kan stabiliseras i olika tillstånd som försöker fånga exakta utvecklingsstadier. Dessa tillstånd upprätthålls av odlingsförhållanden som, även om de fortfarande är suboptimala, begränsar celler i ett preimplantations- (~ embryonala dagar 5-7) eller postimplantationsliknande (~ embryonala dagar 8-14) epiblaststadium12. Transkriptomisk analys visade att hPSCs odlade i PD0325901, XAV939, Gö6983 och leukemihämmande faktor (LIF; kallade PXGL-naiva hPSCs)13,14 liknar blastocystepikblasten jämfört med hPSCs odlade i fibroblasttillväxtfaktor (FGF) 2 och aktivin15 (benämnda grundade hPSCs12) och humana utvidgade pluripotenta stamceller (hEPSC)16 (se analys i referens17, 18,19). Följaktligen matchar transkriptomet för grundade hPSCs bäst med en postimplantation / pre-gastrulation cynomolgus apa epiblast20. Ytterligare molekylära kriterier, som transposonuttryck, DNA-metylering och X-kromosomtillstånd, bekräftade att variationer av det naiva tillståndet mer liknar blastocystepiblasten jämfört med det grundade tillståndet17,21. Slutligen har linjer av naiva hPSCs framgångsrikt härletts direkt från blastocyster med användning av PXGL-odlingsförhållanden22.
Mänskliga tidiga blastocystceller är ännu inte engagerade. Murin härstamningsspecifikation sker från morulastadiet som föregår blastocyststadiet23. Tvärtom har dissociations- och reaggregeringsexperiment visat att de humana trophectodermcellerna i tidiga blastocyster ännu inte är engagerade24. Följaktligen har analys av cellerna i humana blastocyster genom encells RNA-sekvensering (scRNAseq) visat att den första härstamningsspecifikationen (trofoblast/epiblast) inträffar efter bildandet av blastocysthålan7. Denna uppskjutna mänskliga specifikation korrelerar med observationer om att hPSCs är potenta för att bilda trofoblaster 25,26,27 när mus-PSC: er till stor del är engagerade i epiblastlinjen. Dessa kombinerade observationer ledde till möjligheten att naiva hPSCs återspeglar ett blastocyststadium och behåller potentialen att bilda de tre blastocystlinjerna. På senare tid har styrkan hos hPSC för att specificera extraembryoniska analoger föreslagits för att flytta från trophectoderm till amnion under progression från naivt till grundat tillstånd27. Således liknar naiva hPSC: er mer preimplantationssteget 17,18,21 och har en förbättrad förmåga att bilda trofoblaster jämfört med grundade hPSCs27, hEPSC 16 eller mellanliggande omprogrammerade tillstånd28, som är benägna att bilda postimplantationsanaloger10 (Figur 1B ). Det initiala celltillståndet är således avgörande för att bilda lämpliga extraembryoniska analoger. Även om en grundlig sida vid sida-analys av konverterade trophectoderm-analoger återstår att göra, verkar ett PXGL-naivt tillstånd som återspeglar den tidiga blastocysten viktigt för att bilda hifi-blastoider.
Manar till specifikation och morfogenes genom att signalera väghämning. Hämningen av Hippo-signalvägen är en bevarad mekanism som driver trofoblastspecifikation hos möss, kor och människor 9,29,30. Sedan 2013 är det också känt att hämningen av NODAL (A83-01) och det extracellulära signalreglerade kinaset (ERK; PD0325901 eller motsvarande) och aktiveringen av signalvägarna för benmorfogenetiskt protein (BMP) utlöser grundade hPSCs för att aktivera transkriptionsnätverket associerat med trofoblastlinjen 25,31,32,33,34. Dessutom bekräftade nyligen flera rapporter också att hämningen av både NODAL- och ERK-vägen och aktiveringen av BMP underlättar trofoblastdifferentieringen från naiva hPSCs 25,31,32,33,34. Slutligen, om trofoblastspecifikationen utlöses från ett naivt tillstånd, rekapitulerar celler aspekter av utvecklingsprogressionen hos trophectoderm26. Självförnyande linjer som återspeglar blastocysttrophectoderm har dock inte stabiliserats in vitro. Efter trofoblastspecifikation kan induktion av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och Wnt-signalvägar tillsammans med HDAC-hämning underlätta trofoblastutvecklingsprogression34,35 och stabilisera celler i linjer av humana trofoblaststamceller (hTSC) som återspeglar cytotrofoblasterefter implantation 18,35. Sådana linjer kan härledas både från blastocyster och placentavävnader35.
Den andra extraembryoniska härstamningen, kallad PrE, specificeras efter trofoblaster och härstammar från epiblasten 7,9. I motsats till murin PrE36 tros den mänskliga motsvarigheten vara oberoende av FGF som signalerar 37,38. Linjer som återspeglar den extraembryoniska endodermen (kallad nEnd) etablerades från naiva hPSCs genom induktion av signalvägar med hjälp av aktivin A, Wnt och LIF39. Inkonsekvent med embryohämningsexperiment har ERK-hämning visat sig förhindra bildandet av sådana nEND-celler in vitro39. Hittills har sådana linjer inte härletts direkt från blastocyster.
På senare tid har modeller av det tidiga embryot bildats genom att kombinera variationer av de medier som tidigare utvecklats för hTSC35 och nEND-celler39 och därmed använda aktivatorer av den transformerande tillväxtfaktorn β (TGF-β), EGF och Wnt-signalvägar28,40. Dessa embryomodeller bildas vid låg effektivitet (10% -20%) och bildar celler som liknar post- snarare än preimplantationsstadium10, inklusive analoger av postimplantationsepiblasten, trofoblasten, amnion, gastrula, mesodermala vävnader (~ embryonal dag 14) och cytotrofoblaster10. Tvärtom styr en trippel hämning av Hippo-, ERK- och TGF-β vägar effektivt bildandet av blastoider innefattande blastocystliknande celler41. Tillsammans med det ursprungliga celltillståndet föreslår vi att hämning av trippelvägar (Hippo, ERK, TGF-β) är den andra väsentliga parametern för att bilda hifi-blastoider (Figur 1B).
Utvärdera celltillståndet och det reflekterade stadiet med hjälp av scRNAseq. Tillstånden hos celler som utgör blastoider kan utvärderas genom scRNAseq-analys. Deras transkriptionella likhet med specifika embryonala stadier kan mätas med hjälp av enbart blastoidceller och genom jämförelse med grundade hPSCs eller hTSC som återspeglar postimplantationsstadier 20,35. Att utföra klusteranalyser med olika definitionsnivåer avslöjar hur delpopulationer gradvis smälter samman när definitionen minskar, vilket avslöjar klusters likheter. Även om optimaliteten i antalet kluster kan mätas42, informerar högupplöst klustring också om den eventuella närvaron av små onormala delpopulationer, till exempel återspeglar postimplantationsstegen10. Generna som uttrycks differentiellt mellan kluster kan ge information om deras analoger i utvecklingsprocessen genom att bedöma uttrycksnivåerna för referensgenuppsättningar som definierar scenspecifika härstamningar. Detta gör det möjligt att mäta anrikningen av blastoida delpopulationer antingen genom oövervakade avståndskartor (t.ex. med hjälp av toppberikade gener) eller genom genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA)43. Med hjälp av detta blastoidprotokoll bildas endast tre huvudkluster som transkriptionellt återspeglar de tre blastocystlinjerna. Ett kluster innehåller både de initiala naiva hPSC: erna och epiblastanalogen hos blastoiderna. Analys av celler vid olika tidpunkter visade den sekventiella karaktären hos specifikationen av linjer (trofoblaster börjar specificera inom 24 timmar och primitiva endodermceller inom 60 timmar). En högupplöst klustring fångade en subpopulation av celler (3,2%) som uttrycker gener som är specifika för embryon i gastrulationsstadiet (möjligen mesoderm eller amnion). Observera att de initiala naiva hPSC: erna också utgjorde 5% av postimplantationsliknande celler, som tidigarebeskrivits 44. I en andra analys kan blastoidceller slås samman i silico med referensceller isolerade från concepti i olika steg 45,46,47 för att dra slutsatsen om stadiumekvivalens. Här användes celler isolerade från preimplantationskoncepti45,46, in vitro odlade blastocyster45 och embryon i gastrulationsstadiet47 som referenspunkter. Med hjälp av detta protokoll kvantifierades det att de felaktiga blastoidcellerna som avslöjades av högupplöst klustring verkligen kluster med postimplantation mesoderm och amnion. I framtida steg bör transkriptomjämförelse kompletteras med analys av transposonuttryck, DNA-metylering och av X-kromosomstatus som också ger landmärken i utvecklingsstadier21.
Utvärdering av axelbildning och andra funktioner hos humana blastoider. En mogen blastocyst kännetecknas av bildandet av de embryonala-abembryoniska axelmönstrade trofoblasterna för implantation. Med hjälp av detta blastoidprotokoll bildas en axel robust exemplifierad av en mognad av de proximala trofoblasterna (t.ex. NR2F2 + / CDX2-) som förvärvar förmågan att fästa vid endometriella organoidceller endast när de är hormonellt stimulerade48,49. Jämförelse med trofosfärer som inte bildar epiblasten visar att dessa inre celler inducerar anliggande trofoblaster att mogna för att förmedla den initiala fästningen till endometrium. När de odlas i ett utökat odlingsmedium utformat för cynomolgus monkey blastocysts50, expanderar alla tre släktlinjerna från blastoid konsekvent i ytterligare sex dagar (tid motsvarande dag 13) även om deras organisation inte återspeglar det utvecklingsstadiet.
Implikationen av högeffektiva och högkvalitativa mänskliga blastoider. Bevarandet av utvecklingsprinciper som upptäcktes i modellorganismer är i sig svårt att testa i det mänskliga konceptet på grund av den begränsade tillgången och de tekniska svårigheterna att genetiskt och fysiskt manipulera det. En högeffektiv och högkvalitativ blastoidmodell skulle möjliggöra genetiska skärmar och läkemedelsskärmar med hög genomströmning, som ligger till grund för vetenskapliga och biomedicinska upptäckter. Dessutom skulle införlivandet av komplexa genetiska modifieringar för att ändra och registrera biologiska processer komplettera sådana studier. Sammantaget föreslår vi att trippelhämningen (Hippo, TGF-β, ERK) av naiva PXGL hPSCs är ledande för effektiv bildning av högkvalitativa humana blastoider som uppfyller de fyra minimala kriterierna. Den skalbara och mångsidiga karaktären hos detta protokoll gör det lämpligt att generera riktade hypoteser som sedan kan valideras med hjälp av humana blastocyster. Som sådan kommer mänskliga blastoider inte att ersätta användningen av human conceptus för in vitro-forskning utan kan fungera som ett kraftfullt sätt att tratta forskning genom tidigare otillgängliga experimentella metoder i hjärtat av den vetenskapliga och biomedicinska upptäcktsprocessen. Protokollet visar hur man bildar mänskliga blastoider och även hur man analyserar cellerna som finns i blastoiden.
I den aktuella studien visar vi steg för steg hur man etablerar humana blastoider med hög effektivitet med hjälp av ett enkelt och robust protokoll. Vid aggregering av naiva PXGL hPSCs och deras trippelhämning bildas blastoider effektivt (> 70%) och genererar sekventiellt de 3 blastocystanalogerna inom 4 dagar. Begränsningar i blastoidernas effektivitet och kvalitet (t.ex. närvaro av celler utanför målet) kan uppstå om det ursprungliga tillståndet är suboptimalt. Observera att vi har mätt att PXGL hPSCs innehåller cirka 5% av cellerna som återspeglar postimplantationsstegen. Dessa celler kan begränsa bildandet av högkvalitativa blastoider. Utöver det initiala naiva PXGL-tillståndet som återspeglar blastocystepiblasten är en annan avgörande faktor mediet som används för blastoidbildning. För att snabbt bilda blastocystliknande celler och förhindra bildandet av off-target, postimplantationsliknande celler, föreslår vi att trippelvägshämning (Hippo, ERK, TGF-β) är avgörande. Medan olika cellinjer ger olika utbyten av blastoid vid ERK / TGF-β hämning (vanligtvis cirka 10% -20%), resulterar exponering för LPA i bildandet av lika högt blastoidutbyte över alla cellinjer, samtidigt som man använder strikta morfometriska och härstamningsspecifikationskriterier. LPA verkar möjligen på hämningen av Hippo-vägen, som spelar en avgörande roll i den första härstamningssegregeringen mellan epiblast- och trophectoderm-linjer i mus och människa 8,51. Den signifikanta förbättringen av blastoideffektiviteten av LPA tyder på att hippovägsmedierade inre-yttre cellspecifikationsmekanismer som spelas i blastocysten koopteras under blastoidbildning. En nuvarande begränsning ligger i det faktum att vi, på grund av en suboptimalitet hos de protokoll som används för att odla human blastocyst eller blastoider vid tidsekvivalent dag 7-13 (efter blastocyst / blastoidbildning), inte kan bedöma i vilken utsträckning vi korrekt kan modellera utvecklingen efter implantation.
Analys av det transkriptomiska tillståndet hos blastoidcellerna kan enkelt uppnås med hjälp av scRNAseq, adekvata referenskartor och bioinformatiska metoder. Tidigare visade den transkriptomiska analysen att hPSCs odlade i PXGL liknar blastocystepiblasten mer jämfört med det grundade tillståndet. Begränsningar i analysen av data kan uppstå om referenskartan endast består av blastocyststegsceller. Referenskartan bör omfatta celler som härrör från embryon efter implantation för att bedöma förekomsten av potentiella celler utanför målet. I framtiden, för att jämföra blastoidceller, skulle en referenskarta som inkluderar alla vävnader i pre- och postimplantation human conceptus vara extremt värdefull. Dessutom skulle multi-omics encellsreferenskartor, till exempel inklusive transkriptom, kromatintillgänglighet och DNA-metylering, ytterligare hjälpa till. Slutligen skulle standardiserade bioinformatiska metoder för att kvantitativt bedöma likheterna mellan celler från embryomodeller och referenskoncepti, och för att positivt identifiera celler utanför målet ytterligare hjälpa till att opartiskt analysera och jämföra resultat.
Sammantaget har blastoider som bildas genom trippelhämning av Hippo-, TGF-β- och ERK-vägar de fyra egenskaperna hos 1) mycket effektiv morfogenes, 2) korrekt sekvens av härstamningsspecifikation, 3) hög renhet hos blastocystliknande celler på transkriptomnivå, 4) kapacitet att modellera periimplantationsutveckling. Dessa egenskaper hos blastoider kommer att underlätta att bygga hypoteser om blastocystutveckling och implantation, men de rekapitulerar inte tidigare stadier av embryonal utveckling. I motsats till den begränsade tillgängligheten och mångsidigheten hos human blastocyst är blastoider mottagliga för genetiska och läkemedelsskärmar för funktionella undersökningar av blastocystutveckling och implantation. I framtiden kan sådan grundläggande kunskap bidra till att förbättra IVF-medieformuleringen, utveckla preventivmedel efter befruktning och bättre hantera tidig graviditet.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 (ERC-Co grant agreement No.101002317 ‘BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis’). H.H.K. stöds av Austrian Science Fund (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. Vi tackar Yasuhiro Takashima för att dela H9- och H9-GFP-cellinjerna, och Austin Smith, Peter Andrews och Ge Guo för att dela HNES1, Shef6, niPSC 16.2b och cR-NCRM2 cellinjer. Vi tackar Hossein Baharvand för att han delade med sig av endometrieorganoiderna. Vi tackar Joshua M. Brickman för att ha delat RNA isolerat från PrE-differentierade celler och nEND-celler. Vi tackar Shankar Srinivas för att ha delat encells RNA-sekvenseringsdata för peri-gastrulationsembryomet. Vi tackar Aleksand Bykov och Luisa Cochella för teknisk hjälp för SMARTSeq2 biblioteksförberedelser. Vi tackar NGS, Biooptic och Stamcellsanläggningen på IMBA för kritisk hjälp.
Neurobasal media | in house | ||
DMEM/F12 | in house | ||
100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
1 M Hepes | in house | ||
50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
SC-144 | Axon | 2324 | |
XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
Matrigel | basement membrane matrix | ||
Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |