En protokoll som skisserer dannelsen av menneskelige blastoider som effektivt, rettidig og sekvensielt genererer blastocyst-lignende celler.
En modell av den menneskelige blastocysten dannet av stamceller (blastoid) ville støtte vitenskapelige og medisinske fremskritt. Imidlertid vil dens prediktive kraft avhenge av dens evne til effektivt, rettidig og trofast å rekapitulere sekvensene av blastocystutvikling (morfogenese, spesifikasjon, mønster) og å danne celler som reflekterer blastocyststadiet. Her viser vi at naive menneskelige pluripotente stamceller dyrket under PXGL-forhold og deretter triply hemmet for, transformerer vekstfaktor- β, og ekstracellulære signalregulerte kinaseveier gjennomgår effektivt morfogenese for å danne blastoider (>70%). Matchende med utviklingsmessig timing (~ 4 dager), ruller blastoider ut blastocyst-sekvensen av spesifikasjon ved å produsere analoger av trofoblaster og epiblastomer, etterfulgt av dannelsen av analoger av det primitive endodermet og de polare trofoblaster. Dette resulterer i dannelse av celler transkripsjonelt lik blastocyst (>96%) og et mindretall av post-implantasjon analoger. Blastoider effektivt mønster ved å danne embryonal-abembryonic aksen preget av modning av polarregionen (NR2F2+), som får det spesifikke potensialet til retningsbestemt feste til hormonell stimulert endometrial celler, som i utero. En slik menneskelig blastoid er en skalerbar, allsidig og etisk modell for å studere menneskelig utvikling og implantasjon in vitro.
Mangel på eksperimentelle modeller har begrenset forståelsen av tidlig human embryogenese. Dagens kunnskap om menneskespesifikke aspekter ved embryonal utvikling er avledet fra overskudd in vitro befruktning (IVF) embryoer donert til forskning. Imidlertid hindrer den begrensede tilgjengeligheten, vanskelighetene med eksperimentelle manipulasjoner og variabel kvalitet på embryoene vitenskapelige undersøkelser. Tvert imot ville en trofast in vitro-modell av menneskelige embryoer tillate komplekse eksperimentelle manipulasjoner, og dermed gi en etisk mulighet til å utfylle forskningen på menneskelige embryoer 1,2,3,4. En tidligere utviklet modell av mus blastocysts kombinert mus embryonale stamceller og trophoblast stamceller5. I denne detaljerte protokollen beskrives en metode for å generere en modell av den menneskelige blastocysten fra naive pluripotente stamceller som er trofaste mot elementære blastocystkriterier6.
Fire kriterier for menneskelige blastoider. Her, i et forsøk på å etablere en standardisert definisjon av menneskelige blastoider, foreslår vi fire minimale kriterier. Selv om de ikke er uttømmende, kan disse kriteriene tjene som grunnlag for å evaluere parametrene som tillater dannelse av menneskelige blastoider (figur 1A). (1) Blastoider bør dannes effektivt når det gjelder morfologi og generering av analogene til de tre slektene nemlig epiblass (Epi), trophectoderm (TE) og primitive endoderm (PrE). Ineffektivitet vil sannsynligvis peke på en utilstrekkelig innledende celletilstand eller / og kulturtilstand (f.eks. blastoidmedium). (2) Blastoider bør generere analoger av de tre avstamninger i henhold til utviklingssekvensen (Epi / TE først, PrE / polarTE sist) 7,8 og timing (induksjon ~ 3 dager; embryonale dager 5-7)7,9. (3) Blastoider skal danne analoger av blastocyststadiet, men ikke av postimplantasjonsstadier (f.eks. epiblastomer etter implantasjon, trophoblast eller amnionceller). (4) Til slutt bør blastoider være i stand til å recapitulatere funksjonelle egenskaper ved blastocystimplantasjon og utvikling. Ved hjelp av denne protokollen dannes menneskelige blastoider effektivt ved hjelp av flere cellelinjer (>70%), er i stand til å generere blastocyst cellulære analoger sekvensielt og innen 4 dager, og analogene er transkripsjonelt lik blastocyststadiet (>96% basert på flere analyser)6,10,11. Til slutt genererer blastoider robust den embryonale abembryoniske aksen, noe som gjør at de kan samhandle med hormonelt stimulerte endometrieceller gjennom polarområdet, og robust utvide avstamninger ved utvidet kultur (tidsekvivalent: embryonal dag 13).
Betydningen av den opprinnelige celletilstanden. Humane pluripotente stamceller (hPSCer) kan stabiliseres i forskjellige tilstander som forsøker å fange presise utviklingsstadier. Disse tilstandene opprettholdes av kulturforhold som, selv om de fortsatt er suboptimale, begrenser celler i en preimplantasjon- (~ embryonale dager 5-7) eller postimplantasjonslignende (~ embryonale dager 8-14) epiblasttrinn12. Transkripsjonsanalyse viste at hPSCer dyrket i PD0325901, XAV939, Gö6983 og leukemihemmerfaktor (LIF; PXGL naive hPSCer)13,14 er mer lik blastocyst epiblast sammenlignet med hPSCer dyrket i fibroblast vekstfaktor (FGF) 2 og aktivin15 (betegnet primed hPSCs12) og til humane utvidede pluripotente stamceller (hEPSCs)16 (se analyse i referanser17, 18,19). Følgelig passer transkripsjonen av primede hPSCer best med en postimplantasjon / pre-gastrulation cynomolgus ape epiblast20. Ytterligere molekylære kriterier, som transposonuttrykk, DNA-metylering og X-kromosomtilstand, bekreftet at variasjoner av den naive tilstanden ligner mer på blastocyst-epiblasteret sammenlignet med den primede tilstanden 17,21. Til slutt har linjer med naive hPSCer blitt vellykket avledet direkte fra blastocysts ved hjelp av PXGL kulturforhold22.
Menneskelige tidlige blastocystceller er ennå ikke begått. Murine avstamningsspesifikasjon skjer fra morulastadiet som går forut for blastocysttrinnet23. Tvert imot har dissosiasjons- og reaggregeringsforsøk vist at de menneskelige trophectoderm-cellene til tidlige blastocytter ennå ikke er begått24. Følgelig har analyse av cellene i menneskelige blastocyster ved encellet RNA-sekvensering (scRNAseq) vist at den første avstamningsspesifikasjonen (trophoblast / epiblast) oppstår etter dannelsen av blastocysthulen7. Denne utsatte menneskelige spesifikasjonen korrelerer med observasjoner om at hPSCer er potente for å danne trophoblasts 25,26,27 når musen PSCs er i stor grad forpliktet til epiblast avstamning. Disse kombinerte observasjonene førte til muligheten for at naive hPSCer reflekterer et blastocyst stadium og beholder potensialet til å danne de tre blastocyst-avstamningene. I det siste har styrken til hPSCer for å spesifisere ekstraembryoniske analoger blitt foreslått å skifte fra trophectoderm til amnion under progresjon fra naiv til primet tilstand27. Dermed er naive hPSCer mer lik preimplantasjonstrinnet 17,18,21 og har en forbedret kapasitet til å danne trofoblaster sammenlignet med primede hPSCer27, hEPSC16 eller mellomliggende omprogrammerte tilstander28, som er tilbøyelige til å danne postimplantasjonsanaloger 10 (figur 1B ). Den opprinnelige celletilstanden er dermed avgjørende for å danne de riktige ekstraembryoniske analogene. Selv om en grundig side-ved-side analyse av konverterte trophectoderm analoger gjenstår å gjøre, en PXGL naiv tilstand som reflekterer tidlig blastocyst synes viktig å danne high-fidelity blastoids.
Tilskyndende spesifikasjon og morfogenese ved å signalisere veier hemming. Hemmingen av Hippo-signalveien er en bevart mekanisme som driver trophoblastspesifikasjon hos mus, kyr og mennesker 9,29,30. Også siden 2013 er det kjent at hemmingen av NODAL (A83-01) og den ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK; PD0325901 eller tilsvarende) og aktiveringen av signalveiene for benmorfogenetisk protein (BMP) utløser primede hPSCer for å aktivere transkripsjonsnettverket forbundet med trophoblast-linjen 25,31,32,33,34. Videre bekreftet flere rapporter nylig også at hemming av både NODAL og ERK-bane og aktivering av BMP letter trofolastdifferensiering fra naive hPSCer 25,31,32,33,34. Til slutt, hvis trophoblast spesifikasjon utløses fra en naiv tilstand, celler rekapitulere aspekter av utviklingsprogresjonen av trophectoderm26. Imidlertid har selvfornyende linjer som reflekterer blastocyst trophectoderm ikke blitt stabilisert in vitro. Etter trophoblast spesifikasjon, induksjon av epidermal vekstfaktor (EGF) og Wnt signalveier sammen med HDAC hemming kan lette trophoblast utviklingsprogresjon34,35 og stabilisere celler i linjer av humane trophoblast stamceller (hTSCs) reflektere post-implantasjon cytotrophoblasts18,35. Slike linjer kan avledes både fra blastocysts og placental vev35.
Den andre ekstraembryoniske slektslinjen, kalt PrE, er spesifisert etter trofoblaster og stammer fra epiblast 7,9. I motsetning til murine PrE36, antas den menneskelige motparten å være uavhengig av FGF som signaliserer 37,38. Linjer som reflekterer den ekstraembryoniske endodermen (kalt nEnd) ble etablert fra naive hPSCer ved induksjon av signalveier ved hjelp av aktivin A, Wnt og LIF39. Ikke i samsvar med embryoinhiberingsforsøk, har ERK-hemming vist seg å forhindre dannelse av slike nEND-celler in vitro39. Inntil nå har slike linjer ikke blitt avledet direkte fra blastocysts.
I det siste har modeller av det tidlige embryoet blitt dannet ved å kombinere variasjoner av media som tidligere er utviklet for hTSCs35 og nEND-celler39 og dermed ved hjelp av aktivatorer av den transformerende vekstfaktoren- β (TGF-β), EGF og Wnt signalveier28,40. Disse embryomodellene dannes ved lav effektivitet (10%-20%) og danner celler som ligner på post- i stedet for preimplantasjonsstadium10, inkludert analoger av postimplantasjonsepilelast, trophoblast, amnion, gastrula, mesodermalt vev (~ embryonal dag 14) og cytotrophoblaster10. Tvert imot, en trippel hemming av Hippo, ERK og TGF-β veier effektivt styrer dannelsen av blastoider som består av blastocyst-lignende celler41. Sammen med den første celletilstanden foreslår vi at trippelveier hemming (Hippo, ERK, TGF-β) er den andre essensielle parameteren for å danne høy-troskap blastoider (figur 1B).
Evaluere celletilstanden og reflektert stadium ved hjelp av scRNAseq. Tilstandene til celler som komponerer blastoider kan evalueres gjennom scRNAseq-analyse. Deres transkripsjonelle likhet med spesifikke embryonale stadier kan måles ved hjelp av blastoidceller alene og sammenlignet med primede hPSCer eller hTSCer som gjenspeiler postimplantasjonsstadier20,35. Å utføre klyngeanalyser ved hjelp av ulike definisjonsnivåer avslører hvordan delbefolkninger gradvis smelter sammen når definisjonen reduseres, og dermed avslører klyngers likheter. Selv om optimalitet i antall klynger kan måles42, informerer høyoppløselig klynge også om eventuell tilstedeværelse av små unormale subpopulasjoner, for eksempel som reflekterer postimplantasjonsstadiene10. Genene som differensialt uttrykkes mellom klynger kan gi informasjon om sine analoger i utviklingsprosessen ved å vurdere uttrykksnivåene til referansegensett som definerer scenespesifikke avstamninger. Dette gjør det mulig å måle berikelsen av blastoide subpopulations enten gjennom uovervåkede avstandskart (f.eks. ved hjelp av toppberikede gener) eller ved gensettberikelsesanalyse (GSEA)43. Ved hjelp av denne blastoidprotokollen dannes bare tre hovedklynger som transkripsjonsmessig gjenspeiler de tre blastocyste avstamninger. En klynge inkluderer både de første naive hPSCene og epiblastanalogen til blastoidene. Analyse av celler på forskjellige tidspunkter viste den sekvensielle karakteren av avgrensningsspesifikasjon (trofoblaster begynner å spesifisere innen 24 timer, og primitive endodermceller innen 60 timer). En klynge med høy oppløsning fanget en subpopulasjon av celler (3,2%) som uttrykte gener som er spesifikke for gastrulation stadium embryoer (muligens mesoderm eller amnion). Vær oppmerksom på at de første naive hPSCene også besto av 5% av postimplantasjonslignende celler, som tidligere beskrevet44. I en annen analyse kan blastoidceller slås sammen i silico med referanseceller isolert fra concepti på forskjellige stadier 45,46,47 for å utlede stadium ekvivalens. Her ble celler isolert fra preimplantasjonskonsepti45,46, in vitrokulturerte blastocytter45, og gastrulation-stage embryoer47 brukt som referansepunkter. Ved hjelp av denne protokollen ble det kvantifisert at de ikke samsvarende blastoidcellene avslørt av høyoppløselig klynge faktisk klynge med postimplantasjon mesoderm og amnion. I fremtidige trinn bør transkripsjons benchmarking suppleres med analyse av transposonuttrykk, DNA-metylering og X-kromosomstatus som også gir landemerker av utviklingsstadier21.
Evaluering av aksedannelse og andre funksjoner i menneskelige blastoider. En moden blastocyst er preget av dannelsen av embryonal-abembryonisk akse som mønstrer trofoblaster for implantasjon. Ved hjelp av denne blastoidprotokollen dannes en akse robust eksemplifisert ved modning av de proksimale trofoblaster (f.eks. NR2F2+/CDX2-) som får kapasitet til å feste seg til endometriale organoidceller bare når de er hormonelt stimulert48,49. Sammenligning med trofosfærer som ikke danner epiblasten viser at disse indre cellene induserer tilstøtende trofoblaster for å modnes for å formidle det første vedlegget til endometriumet. Når det dyrkes i et utvidet kulturmedium designet for cynomolgus monkey blastocysts50, utvides alle tre avstamninger fra blastoiden konsekvent i seks ekstra dager (tidsekvivalent med dag 13), selv om organisasjonen deres ikke gjenspeiler det utviklingsstadiet.
Implikasjonen av høy effektivitet og high-fidelity menneskelige blastoider. Bevaring av utviklingsprinsipper som ble oppdaget i modellorganismer er iboende vanskelig å teste i det menneskelige konseptus på grunn av begrenset tilgang og til de tekniske vanskelighetene ved genetisk og fysisk manipulering av det. En høyeffektiv og høy-troskap blastoid modell ville tillate høy gjennomstrømning genetiske og narkotika skjermer, som er på grunnlag av vitenskapelige og biomedisinske funn. I tillegg vil inkorporering av komplekse genetiske modifikasjoner for å endre og registrere biologiske prosesser utfylle slike studier. Totalt sett foreslår vi at trippelinhibering (Hippo, TGF-β, ERK) av naive PXGL hPSCer er ledende for effektiv dannelse av high-fidelity menneskelige blastoider som overholder de fire minimale kriteriene. Den skalerbare og allsidige karakteren til denne protokollen gjør den egnet til å generere målrettede hypoteser som deretter kan valideres ved hjelp av menneskelige blastocytter. Som sådan vil menneskelige blastoider ikke erstatte bruken av menneskelig conceptus for in vitro-forskning , men kan fungere som en kraftig måte å trakte forskning gjennom tidligere utilgjengelige eksperimentelle tilnærminger i hjertet av den vitenskapelige og biomedisinske oppdagelsesprosessen. Protokollen viser hvordan man danner menneskelige blastoider og også hvordan man analyserer cellene som finnes i blastoiden.
I den nåværende studien viser vi, trinnvis, hvordan man etablerer menneskelige blastoider med høy effektivitet ved hjelp av en enkel og robust protokoll. Ved aggregering av naive PXGL hPSCer og deres trippel inhibering dannes blastoider effektivt (> 70%) og genererer sekvensielt de 3 blastocystanalogene innen 4 dager. Begrensninger i effektiviteten og kvaliteten på blastoidene (f.eks. tilstedeværelse av off-target celler) kan oppstå hvis den opprinnelige tilstanden er sub-optimal. Vær oppmerksom på at vi har målt at PXGL hPSCer inneholder omtrent 5% av cellene som reflekterer postimplantasjonsstadiene. Disse cellene kan begrense dannelsen av høykvalitets blastoider. Utover den første naive PXGL-tilstanden som gjenspeiler blastocyst-epiblastomet, er en annen sentral faktor mediet som brukes til blastoiddannelse. For raskt å danne blastocyst-lignende celler og forhindre dannelse av off-target, post-implantasjon-lignende celler, foreslår vi at trippel veier hemming (Hippo, ERK, TGF-β) er viktig. Mens forskjellige cellelinjer gir forskjellige utbytter av blastoid på ERK / TGF-β-hemming (vanligvis rundt 10% -20%), resulterer eksponering for LPA i dannelsen av like høyt blastoid avkastning på tvers av alle cellelinjer, mens du bruker strenge morfometriske og avledningsspesifikasjonskriterier. LPA virker muligens på hemming av Hippo-banen, som spiller en kritisk rolle i den første avgrensningssegregeringen mellom epiblast og trophectoderm-avgrensninger i mus og menneske 8,51. Den betydelige forbedringen av blastoideffektiviteten fra LPA antyder at Hippo-banen-medierte indre-ytre cellespesifikasjonsmekanismer som spilles i blastocysten, er samvalgt under blastoiddannelse. En nåværende begrensning ligger i det faktum at på grunn av en sub-optimalitet av protokollene som brukes til å dyrke menneskelig blastocyst eller blastoider på tidsekvivalent dag 7-13 (etter blastocyst / blastoid formasjon), er vi ikke i stand til å vurdere i hvilken grad vi kan modellere etterimplantasjonsutvikling riktig.
Analyse av blastoidcellenes transkripsjonstilstand kan enkelt oppnås ved hjelp av scRNAseq, tilstrekkelige referansekart og bioinformatiske metoder. Tidligere viste den transkripsjonsanalysen at hPSCer dyrket i PXGL er mer lik blastocyst-epiblastomet sammenlignet med den primede tilstanden. Begrensninger i analysen av dataene kan oppstå hvis referansekartet bare består av blastocystfaseceller. Referansekartet bør inneholde celler som stammer fra embryoer etter implantasjon for å vurdere tilstedeværelsen av potensielle off-target celler. I fremtiden, for å måle blastoidceller, ville et referansekart inkludert alle vevene i pre- og postimplantasjons-menneskelige conceptus være ekstremt verdifullt. I tillegg vil multi-omics enkeltcellereferansekart, for eksempel transkripsjon, kromatintilgjengelighet og DNA-metylering, ytterligere hjelpe. Til slutt vil standardiserte bioinformatiske metoder for kvantitativt å vurdere likhetene mellom celler fra embryomodeller og referansekonsepti, og å identifisere off-target celler positivt bidra til å analysere og sammenligne resultater objektivt.
Til sammen har blastoider dannet av trippel inhibering av Hippo, TGF-β og ERK-veier de fire egenskapene til 1) svært effektiv morfogenese, 2) riktig sekvens av avstamningsspesifikasjon, 3) høy renhet av blastocystlignende celler på transkripsjonsnivå, 4) kapasitet til å modellere peri-implantasjonsutvikling. Disse egenskapene til blastoider vil lette bygging av hypoteser om blastocystutvikling og implantasjon, men de recapitulaterer ikke tidligere stadier av embryonal utvikling. I motsetning til den begrensede tilgjengeligheten og allsidigheten til menneskelig blastocyst, er blastoider mottagelige for genetiske og narkotikaskjermer for funksjonelle undersøkelser av blastocystutvikling og implantasjon. I fremtiden kan slik grunnleggende kunnskap bidra til å forbedre IVF-medieformuleringen, utvikle prevensjonsmidler etter befruktning og bedre håndtere tidlig graviditet.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (ERC-Co grant agreement No.101002317 ‘BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis’). H.H.K. støttes av Det østerrikske vitenskapsfondet (FWF), Lise Meitner Program M3131-B. Vi takker Yasuhiro Takashima for å ha delt cellelinjene H9 og H9-GFP, og Austin Smith, Peter Andrews og Ge Guo for å ha delt cellelinjene HNES1, Shef6, niPSC 16.2b og cR-NCRM2. Vi takker Hossein Baharvand for å ha delt endometrieoroidene. Vi takker Joshua M. Brickman for at han delte RNA isolert fra PrE-differensierte celler og nEND-celler. Vi takker Shankar Srinivas for å dele encellede RNA-sekvenseringsdata fra peri-gastrulation embryoet. Vi takker Aleksand Bykov og Luisa Cochella for teknisk assistanse for SMARTSeq2 bibliotekforberedelse. Vi takker NGS-, Biooptic- og Stem Cell-anlegget på IMBA for kritisk assistanse.
Neurobasal media | in house | ||
DMEM/F12 | in house | ||
100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
1 M Hepes | in house | ||
50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
SC-144 | Axon | 2324 | |
XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
Matrigel | basement membrane matrix | ||
Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |