मानव ब्लास्टोइड्स के गठन को रेखांकित करने वाला एक प्रोटोकॉल जो कुशलतापूर्वक, समय पर और क्रमिक रूप से ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है।
स्टेम कोशिकाओं (ब्लास्टोइड) से गठित मानव ब्लास्टोसिस्ट का एक मॉडल वैज्ञानिक और चिकित्सा प्रगति का समर्थन करेगा। हालांकि, इसकी भविष्य कहनेवाला शक्ति ब्लास्टोसिस्ट विकास (मॉर्फोजेनेसिस, विनिर्देश, पैटर्निंग) के अनुक्रमों को कुशलतापूर्वक, समय पर और ईमानदारी से पुनरावृत्ति करने और ब्लास्टोसिस्ट चरण को प्रतिबिंबित करने वाली कोशिकाओं को बनाने की क्षमता पर निर्भर करेगी। यहां हम दिखाते हैं कि भोले मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को पीएक्सजीएल स्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है और फिर हिप्पो के लिए त्रिकोणीय रूप से बाधित होता है, विकास कारक-β को बदलता है, और बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेज मार्ग कुशलतापूर्वक ब्लास्टोइड्स (>70%) बनाने के लिए मॉर्फोजेनेसिस से गुजरते हैं। विकास ता्मक समय (~ 4 दिन) के साथ मिलान करते हुए, ब्लास्टोइड्स ट्रोफोब्लास्ट और एपिब्लास्ट के एनालॉग्स का उत्पादन करके विनिर्देश के ब्लास्टोसिस्ट अनुक्रम को अनरोल करते हैं, इसके बाद आदिम एंडोडर्म और ध्रुवीय ट्रोफोब्लास्ट्स के एनालॉग्स का गठन होता है। इसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं का गठन ट्रांसक्रिप्शनल रूप से ब्लास्टोसिस्ट (>96%) के समान होता है और पोस्ट-इम्प्लांटेशन एनालॉग्स का अल्पसंख्यक होता है। ध्रुवीय क्षेत्र (एनआर 2 एफ 2 +) की परिपक्वता द्वारा चिह्नित भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष बनाकर ब्लास्टोइड्स कुशलतापूर्वक पैटर्न करते हैं, जो गर्भाशय के रूप में हार्मोनल रूप से उत्तेजित एंडोमेट्रियल कोशिकाओं को दिशात्मक रूप से संलग्न करने की विशिष्ट क्षमता प्राप्त करता है। इस तरह के एक मानव ब्लास्टोइड इन विट्रो में मानव विकास और आरोपण का अध्ययन करने के लिए एक स्केलेबल, बहुमुखी और नैतिक मॉडल है।
प्रयोगात्मक मॉडल की कमी ने प्रारंभिक मानव भ्रूणजनन की समझ को सीमित कर दिया है। भ्रूण विकास के मानव-विशिष्ट पहलुओं का वर्तमान ज्ञान अनुसंधान के लिए दान किए गए इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) भ्रूण में अधिशेष से लिया गया है। हालांकि, सीमित उपलब्धता, प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की कठिनाइयों, और भ्रूण की चर गुणवत्ता वैज्ञानिक जांच में बाधा डालती है। इसके विपरीत, मानव भ्रूण के इन विट्रो मॉडल में एक वफादार जटिल प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देगा, इस प्रकार मानव भ्रूण 1,2,3,4 पर अनुसंधान के पूरक के लिए एक नैतिक अवसर प्रदान करेगा। माउस ब्लास्टोसिस्ट के पहले से विकसित मॉडल ने माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओंको संयुक्त किया 5. इस विस्तृत प्रोटोकॉल में, भोले प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव ब्लास्टोसिस्ट का एक मॉडल उत्पन्न करने की एक विधि जो मौलिक ब्लास्टोसिस्ट मानदंडों के प्रति वफादार है, 6 का वर्णन किया गया है।
मानव ब्लास्टोइड्स के लिए चार मानदंड। यहां, मानव ब्लास्टोइड्स की एक मानकीकृत परिभाषा स्थापित करने के प्रयास में, हम चार न्यूनतम मानदंडों का प्रस्ताव करते हैं। यद्यपि संपूर्ण नहीं है, ये मानदंड उन मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकते हैं जो मानव ब्लास्टोइड्स (चित्रा 1 ए) के गठन की अनुमति देते हैं। (1) ब्लास्टोइड्स को आकृति विज्ञान के संदर्भ में और तीन वंशों के एनालॉग्स की पीढ़ी के संदर्भ में कुशलतापूर्वक बनना चाहिए, अर्थात्, एपिब्लास्ट (एपि), ट्रॉफेक्टोडर्म (टीई), और आदिम एंडोडर्म (पीआरई)। अक्षमता एक अपर्याप्त प्रारंभिक सेल राज्य या / और संस्कृति की स्थिति (जैसे, ब्लास्टॉइड माध्यम) को इंगित करने की संभावना है। (2) ब्लास्टोइड्स को विकासात्मक अनुक्रम (एपीआई / टीई पहले, पीआरई / पोलरटीई अंतिम) 7,8 और समय (प्रेरण ~ 3 दिन; भ्रूण के दिन 5-7) 7,9) के अनुसार तीन वंशों के एनालॉग उत्पन्न करना चाहिए। (3) ब्लास्टोइड्स को ब्लास्टोसिस्ट चरण के एनालॉग बनाना चाहिए, लेकिन आरोपण के बाद के चरणों (उदाहरण के लिए, पोस्ट-इम्प्लांटेशन एपिब्लास्ट, ट्रोफोब्लास्ट, या एमनियन कोशिकाओं) का नहीं। (4) अंत में, ब्लास्टोइड्स को ब्लास्टोसिस्ट प्रत्यारोपण और विकास की कार्यात्मक विशेषताओं को फिर से तैयार करने में सक्षम होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, मानव ब्लास्टोइड्स कई सेल लाइनों (>70%) का उपयोग करके कुशलतापूर्वक बनते हैं, ब्लास्टोसिस्ट सेलुलर एनालॉग्स को क्रमिक रूप से और 4 दिनों के भीतर उत्पन्न करने में सक्षम होते हैं, और एनालॉग्स ब्लास्टोसिस्ट चरण (>96% कई विश्लेषण के आधार पर) 6,10,11 के समान होते हैं। अंत में, ब्लास्टोइड्स भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष को मजबूती से उत्पन्न करते हैं, जो उन्हें ध्रुवीय क्षेत्र के माध्यम से हार्मोनल रूप से उत्तेजित एंडोमेट्रियल कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है, और विस्तारित संस्कृति (समय-समतुल्य: भ्रूण दिवस 13) पर वंशावली का मजबूती से विस्तार करता है।
प्रारंभिक सेल राज्य का महत्व। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचपीएससी) को विभिन्न राज्यों में स्थिर किया जा सकता है जो सटीक विकास ता्मक चरणों को पकड़ने का प्रयास करते हैं। इन राज्यों को संस्कृति की स्थिति द्वारा बनाए रखा जाता है, हालांकि अभी भी सबऑप्टिमल, कोशिकाओं को पूर्व-आरोपण- (~ भ्रूण के दिन 5-7) या पोस्ट-इम्प्लांटेशन-जैसे (~ भ्रूण के दिन 8-14) एपिब्लास्ट चरण12 में बाधित करते हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि पीडी0325901, एक्सएवी 9 3 9, गो 6 9 83, और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ; जिसे पीएक्सजीएल भोले एचपीएससी कहा जाता है) 13,14 में सुसंस्कृत एचपीएससी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) 2 और एक्टिविन 15 (प्राइमेड एचपीएससी 12 कहा जाता है) में सुसंस्कृत एचपीएससी की तुलना में ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट के समान हैं। 18,19)। तदनुसार, प्राइमेड एचपीएससी का ट्रांसक्रिप्टोम पोस्ट-इम्प्लांटेशन / प्री-गैस्ट्रुलेशन सिनोमोलगस बंदर एपिब्लास्ट20 के साथ सबसे अच्छा मेल खाता है। ट्रांसपोसन अभिव्यक्ति, डीएनए मिथाइलेशन और एक्स गुणसूत्र राज्य जैसे अतिरिक्त आणविक मानदंडों ने पुष्टि की कि भोले राज्य की विविधताएं प्राइमेड राज्य17,21 की तुलना में ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट से अधिक निकटता से मिलती-जुलती हैं। अंत में, भोले एचपीएससी की लाइनों को पीएक्सजीएल संस्कृति स्थितियों22 का उपयोग करके ब्लास्टोसिस्ट से सीधे सीधे प्राप्त किया गया है।
मानव प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट कोशिकाएं अभी तक प्रतिबद्ध नहीं हैं। मुरिन वंश विनिर्देश मोरुला चरण से होता है जो ब्लास्टोसिस्ट चरण23 से पहले होता है। इसके विपरीत, पृथक्करण और पुन: एकत्रीकरण प्रयोगों से पता चला है कि प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट की मानव ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाएं अभी तक प्रतिबद्ध नहीं हैं। तदनुसार, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनएएसईक्यू) द्वारा मानव ब्लास्टोसिस्ट की कोशिकाओं के विश्लेषण से पता चला है कि ब्लास्टोसिस्ट गुहा7 के गठन के बाद पहला वंश विनिर्देश (ट्रोफोब्लास्ट / यह आस्थगित मानव विनिर्देश टिप्पणियों से संबंधित है कि एचपीएससी ट्रोफोब्लास्ट्स 25,26,27 बनाने के लिए शक्तिशाली हैं जब माउस पीएससी काफी हद तक एपिब्लास्ट वंश के लिए प्रतिबद्ध हैं। इन संयुक्त टिप्पणियों ने इस संभावना को जन्म दिया कि भोले एचपीएससी एक ब्लास्टोसिस्ट चरण को दर्शाते हैं और तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों को बनाने की क्षमता को बनाए रखते हैं। हाल ही में, एक्सट्राएम्ब्रायोनिक एनालॉग्स को निर्दिष्ट करने के लिए एचपीएससी की शक्ति को भोले से प्राइमेड राज्य27 में प्रगति के दौरान ट्रॉफेक्टोडर्म से एमनियन में स्थानांतरित करने का प्रस्ताव दिया गया है। इस प्रकार, भोले एचपीएससी पूर्व-आरोपण चरण17,18,21 के समान हैं और प्राइमेड एचपीएससी 27, एचईपीएससी16, या मध्यवर्ती पुन: प्रोग्राम किए गए राज्यों28 की तुलना में ट्रोफोब्लास्ट बनाने की बढ़ी हुई क्षमता है, जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन एनालॉग10 (चित्रा 1 बी) बनाने के लिए प्रवण हैं ). प्रारंभिक सेल राज्य इस प्रकार उपयुक्त एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक एनालॉग बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। यद्यपि परिवर्तित ट्रोफेक्टोडर्म एनालॉग्स का पूरी तरह से साइड-बाय-साइड विश्लेषण किया जाना बाकी है, प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट को दर्शाने वाला एक पीएक्सजीएल भोली स्थिति उच्च-निष्ठा वाले ब्लास्टोइड बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होती है।
सिग्नलिंग मार्ग निषेध द्वारा विनिर्देश और मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करना। हिप्पो सिग्नलिंग मार्ग का निषेध चूहों, गायों और मनुष्यों 9,29,30 में ट्रोफोब्लास्ट विनिर्देश को चलाने वाला एक संरक्षित तंत्र है। इसके अलावा, 2013 के बाद से, यह ज्ञात है कि नोडल (ए 83-01) और बाह्य संकेत-विनियमित किनेज (ईआरके; पीडी0325901 या समकक्ष) और हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता ट्रोफोब्लास्ट वंश 25,31,32,33,34 से जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क को सक्रिय करने के लिए प्राइमेड एचपीएससी को ट्रिगर करती है। इसके अलावा, हाल ही में कई रिपोर्टों ने यह भी पुष्टि की कि नोडल और ईआरके मार्ग दोनों का निषेध और बीएमपी की सक्रियता भोले एचपीएससी 25,31,32,33,34 से ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की सुविधा प्रदान करती है। अंत में, यदि ट्रोफोब्लास्ट विनिर्देश एक भोली अवस्था से ट्रिगर होता है, तो कोशिकाएं ट्रोफेक्टोडर्म26 की विकासात्मक प्रगति के पहलुओं को दोहराती हैं। हालांकि, ब्लास्टोसिस्ट ट्रॉफेक्टोडर्म को दर्शाती आत्म-नवीनीकरण लाइनों को इन विट्रो में स्थिर नहीं किया गया है। ट्रोफोब्लास्ट विनिर्देश के बाद, एचडीएसी अवरोध के साथ एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्गों का प्रेरण ट्रोफोब्लास्ट विकास ता्मक प्रगति34,35 की सुविधा प्रदान कर सकता है और कोशिकाओं को मानव ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओं (एचटीएससी) की लाइनों में स्थिर कर सकता है जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन साइटोट्रोफोब्लास्ट्स18,35 को दर्शाता है। ऐसी रेखाओं को ब्लास्टोसिस्ट और प्लेसेंटल ऊतकों35 दोनों से प्राप्त किया जा सकता है।
दूसरा एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक वंश, जिसे पीआरई कहा जाता है, ट्रोफोब्लास्ट्स के बाद निर्दिष्ट किया जाता है और एपिब्लास्ट 7,9 से निकलता है। मुरिन प्रीई36 के विपरीत, मानव समकक्ष को एफजीएफ सिग्नलिंग37,38 से स्वतंत्र माना जाता है। एक्सट्राम्ब्रायोनिक एंडोडर्म (जिसे एनएंड कहा जाता है) को प्रतिबिंबित करने वाली रेखाओं को एक्टिविन ए, डब्ल्यूएनटी और एलआईएफ39 का उपयोग करके सिग्नलिंग मार्गों के प्रेरण द्वारा भोले एचपीएससी से स्थापित किया गया था। भ्रूण निषेध प्रयोगों के साथ असंगत, ईआरके अवरोध को इन विट्रो39 में ऐसी एनईएनडी कोशिकाओं के गठन को रोकने के लिए दिखाया गया है। अब तक, ऐसी पंक्तियों को सीधे ब्लास्टोसिस्ट से प्राप्त नहीं किया गया है।
हाल ही में, शुरुआती भ्रूण के मॉडल एचटीएससी35 और एनईएनडी कोशिकाओं39 के लिए पहले से विकसित मीडिया की विविधताओं के संयोजन से बनाए गए हैं, इस प्रकार परिवर्तनकारी विकास कारक-β (टीजीएफ -β), ईजीएफ, और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्गों28,40 के सक्रियकर्ताओं का उपयोग करके। ये भ्रूण मॉडल कम दक्षता (10% -20%) पर बनते हैं और पूर्व-आरोपण चरण 10 के बजाय पोस्ट-इंप्लांटेशन स्टेज10 जैसी कोशिकाएं बनाते हैं, जिसमें पोस्ट-इम्प्लांटेशन एपिब्लास्ट, ट्रोफोब्लास्ट, एमनियन, गैस्ट्रुला, मेसोडर्मल ऊतकों (~ भ्रूण दिवस 14), और साइटोट्रॉफोब्लास्ट्स10 के एनालॉग शामिल हैं। इसके विपरीत, हिप्पो, ईआरके, और टीजीएफ-β मार्गों का एक ट्रिपल अवरोध कुशलतापूर्वक ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं41 सहित ब्लास्टोइड्स के गठन का मार्गदर्शन करता है। प्रारंभिक सेल राज्य के साथ, हम प्रस्ताव करते हैं कि ट्रिपल पाथवे निषेध (हिप्पो, ईआरके, टीजीएफ -β) उच्च-निष्ठा वाले ब्लास्टोइड्स (चित्रा 1 बी) बनाने के लिए दूसरा आवश्यक पैरामीटर है।
एससीआरएनएएसईक्यू का उपयोग करके सेल राज्य और परिलक्षित चरण का मूल्यांकन करना। ब्लास्टोइड्स की रचना करने वाली कोशिकाओं की स्थिति का मूल्यांकन एससीआरएनएसेक विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है। विशिष्ट भ्रूण चरणों के लिए उनकी ट्रांसक्रिप्शनल समानता को अकेले ब्लास्टोइड कोशिकाओं का उपयोग करके और प्राइमेड एचपीएससी या एचटीएससी के साथ तुलना करके मापा जा सकता है जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन चरणों20,35 को दर्शाते हैं। परिभाषा के विभिन्न स्तरों का उपयोग करके क्लस्टर विश्लेषण करने से पता चलता है कि परिभाषा कम होने पर उप-आबादी उत्तरोत्तर विलय कैसे होती है, इस प्रकार समूहों की समानताओं का खुलासा करती है। यद्यपि समूहों की संख्या में इष्टतमताको 42 मापा जा सकता है, उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टरिंग भी छोटे असामान्य उप-आबादी की अंतिम उपस्थिति पर सूचित करता है, उदाहरण के लिए पोस्ट-इम्प्लांटेशन चरणों10 को दर्शाता है। समूहों के बीच अलग-अलग व्यक्त जीन चरण-विशिष्ट वंशों को परिभाषित करने वाले संदर्भ जीन सेटों के अभिव्यक्ति स्तरों का आकलन करके विकास प्रक्रिया में उनके एनालॉग्स पर जानकारी प्रदान कर सकते हैं। यह ब्लास्टोइड उप-आबादी के संवर्धन को मापने की अनुमति देता है या तो असुरक्षित दूरी के नक्शे (उदाहरण के लिए, शीर्ष समृद्ध जीन का उपयोग करके) या जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) 43 द्वारा। इस ब्लास्टोइड प्रोटोकॉल का उपयोग करके, केवल तीन मुख्य क्लस्टर बनते हैं जो ट्रांसक्रिप्शनल रूप से तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों को प्रतिबिंबित करते हैं। एक क्लस्टर में प्रारंभिक भोले एचपीएससी और ब्लास्टोइड्स के एपिब्लास्ट एनालॉग दोनों शामिल हैं। विभिन्न समय बिंदुओं पर कोशिकाओं का विश्लेषण वंशावली विनिर्देश की अनुक्रमिक प्रकृति को दर्शाता है (ट्रोफोब्लास्ट 24 घंटे के भीतर निर्दिष्ट करना शुरू करते हैं, और 60 घंटे के भीतर आदिम एंडोडर्म कोशिकाएं)। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टरिंग ने कोशिकाओं (3.2%) की एक उप-आबादी पर कब्जा कर लिया, जो गैस्ट्रुलेशन चरण भ्रूण (संभवतः मेसोडर्म या एमनियन) के लिए विशिष्ट जीन व्यक्त करता है। ध्यान दें, प्रारंभिक भोले एचपीएससी में 5% पोस्ट-इम्प्लांटेशन जैसी कोशिकाएं भी शामिल थीं, जैसा कि पहलेवर्णित 44 था। एक दूसरे विश्लेषण में, ब्लास्टोइड कोशिकाओं को सिलिको में अलग-अलग चरणों45,46,47 पर अवधारणा से अलग संदर्भ कोशिकाओं के साथ विलय किया जा सकता है ताकि चरण तुल्यता का अनुमान लगाया जा सके। यहां, पूर्व-आरोपण अवधारणा45,46 से अलग कोशिकाओं, इन विट्रो सुसंस्कृत ब्लास्टोसिस्ट45 में, और गैस्ट्रुलेशन-चरण भ्रूण47 का उपयोग संदर्भ बिंदुओं के रूप में किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, यह मात्रा निर्धारित की गई थी कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टरिंग द्वारा प्रकट बेमेल ब्लास्टोइड कोशिकाएं वास्तव में पोस्ट-इम्प्लांटेशन मेसोडर्म और एमनियन के साथ क्लस्टर करती हैं। भविष्य के चरणों में, ट्रांसक्रिप्टोम बेंचमार्किंग को ट्रांसपोसन अभिव्यक्ति, डीएनए मिथाइलेशन और एक्स गुणसूत्र स्थिति के विश्लेषण के साथ पूरक किया जाना चाहिए जो विकास ता्मक चरणों21 के स्थलों को भी प्रदान करता है।
मानव ब्लास्टोइड्स के अक्ष गठन और अन्य कार्यात्मकताओं का मूल्यांकन करना। एक परिपक्व ब्लास्टोसिस्ट को आरोपण के लिए भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष पैटर्निंग ट्रोफोब्लास्ट्स के गठन की विशेषता है। इस ब्लास्टोइड प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक अक्ष मजबूत रूप से समीपस्थ ट्रोफोब्लास्ट्स (उदाहरण के लिए, एनआर 2 एफ 2 + / सीडीएक्स 2-) की परिपक्वता द्वारा उदाहरण दिया जाता है जो एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड कोशिकाओं से जुड़ने की क्षमता प्राप्त करते हैं जब वे हार्मोनल रूप से उत्तेजित48,49 होते हैं। ट्रोफोस्फीयर के साथ तुलना जो एपिब्लास्ट नहीं बनाती है, यह दर्शाती है कि ये आंतरिक कोशिकाएं ट्रोफोब्लास्ट्स को परिपक्व होने के लिए प्रेरित करती हैं ताकि एंडोमेट्रियम के लिए प्रारंभिक लगाव को मध्यस्थता की जा सके। जब सिनोमोलगस बंदर ब्लास्टोसिस्ट50 के लिए डिज़ाइन किए गए एक विस्तारित संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, तो ब्लास्टोइड से सभी तीन वंश लगातार छह अतिरिक्त दिनों (दिन 13 के समय-समतुल्य) के लिए विस्तार करते हैं, हालांकि उनका संगठन उस विकास ता्मक चरण को प्रतिबिंबित नहीं करता है।
उच्च दक्षता और उच्च-निष्ठा वाले मानव ब्लास्टोइड्स का निहितार्थ। मॉडल जीवों में खोजे गए विकास ता्मक सिद्धांतों का संरक्षण सीमित पहुंच के कारण और आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से हेरफेर करने में तकनीकी कठिनाइयों के कारण मानव अवधारणा में परीक्षण करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल है। एक उच्च दक्षता और उच्च-निष्ठा ब्लास्टोइड मॉडल उच्च-थ्रूपुट आनुवंशिक और दवा स्क्रीन के लिए अनुमति देगा, जो वैज्ञानिक और जैव चिकित्सा खोजों के आधार पर हैं। इसके अलावा, जैविक प्रक्रियाओं को बदलने और रिकॉर्ड करने के लिए जटिल आनुवंशिक संशोधनों का समावेश ऐसे अध्ययनों का पूरक होगा। कुल मिलाकर, हम प्रस्ताव करते हैं कि भोले पीएक्सजीएल एचपीएससी का ट्रिपल अवरोध (हिप्पो, टीजीएफ -β, ईआरके) चार न्यूनतम मानदंडों का अनुपालन करने वाले उच्च-निष्ठा वाले मानव ब्लास्टोइड्स के कुशल गठन के लिए प्रवाहकीय है। इस प्रोटोकॉल की स्केलेबल और बहुमुखी प्रकृति लक्षित परिकल्पनाओं को उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त बनाती है जिन्हें मानव ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है। जैसे, मानव ब्लास्टोइड्स इन विट्रो अनुसंधान के लिए मानव अवधारणा के उपयोग को प्रतिस्थापित नहीं करेंगे, लेकिन वैज्ञानिक और बायोमेडिकल खोज प्रक्रिया के केंद्र में पहले से दुर्गम प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के माध्यम से अनुसंधान को फ़नल करने के लिए एक शक्तिशाली तरीके के रूप में कार्य कर सकते हैं। प्रोटोकॉल से पता चलता है कि मानव ब्लास्टोइड कैसे बनाया जाए और यह भी कि ब्लास्टोइड के भीतर निहित कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए।
वर्तमान अध्ययन में, हम दिखाते हैं, कदम से कदम, एक सरल और मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग करके उच्च क्षमता के साथ मानव ब्लास्टोइड ्स को कैसे स्थापित किया जाए। भोले पीएक्सजीएल एचपीएससी और उनके ट्रिपल अवरोध के एकत्रीकरण पर, ब्लास्टोइड कुशलतापूर्वक (> 70%) बनते हैं और क्रमिक रूप से 4 दिनों के भीतर 3 ब्लास्टोसिस्ट एनालॉग उत्पन्न करते हैं। ब्लास्टोइड्स की दक्षता और गुणवत्ता में सीमाएं (उदाहरण के लिए, ऑफ-टारगेट कोशिकाओं की उपस्थिति) हो सकती हैं यदि प्रारंभिक स्थिति उप-इष्टतम है। ध्यान दें, हमने मापा है कि पीएक्सजीएल एचपीएससी में लगभग 5% कोशिकाएं होती हैं जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन चरणों को दर्शाती हैं। ये कोशिकाएं उच्च गुणवत्ता वाले ब्लास्टोइड्स के गठन को सीमित कर सकती हैं। प्रारंभिक भोले पीएक्सजीएल राज्य से परे जो ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट को दर्शाता है, एक और निर्णायक कारक ब्लास्टोइड गठन के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम है। तेजी से ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं को बनाने और ऑफ-टारगेट, पोस्ट-इम्प्लांटेशन जैसी कोशिकाओं के गठन को रोकने के लिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि ट्रिपल पाथवे निषेध (हिप्पो, ईआरके, टीजीएफ -β) आवश्यक है। टीजीएफ-β निषेध (आमतौर पर लगभग 10% -20%) पर ब्लास्टॉइड की अलग-अलग पैदावार देते हैं, एलपीए के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप सख्त मॉर्फोमेट्रिक और वंश विनिर्देश मानदंडों का उपयोग करते हुए सभी सेल लाइनों में समान रूप से उच्च ब्लास्टोइड उपज का गठन होता है। एलपीए संभवतः हिप्पो मार्ग के निषेध पर कार्य करता है, जो माउस और मानव 8,51 में एपिब्लास्ट और ट्रॉफेक्टोडर्म वंशावली के बीच पहले वंश अलगाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एलपीए द्वारा ब्लास्टोइड दक्षता के महत्वपूर्ण सुधार से पता चलता है कि ब्लास्टोसिस्ट में खेलने पर हिप्पो पाथवे-मध्यस्थता वाले आंतरिक-बाहरी सेल विनिर्देश तंत्र को ब्लास्टोइड गठन के दौरान सह-चुना जाता है। एक वर्तमान सीमा इस तथ्य में निहित है कि, समय-समतुल्य दिन 7-13 (ब्लास्टोसिस्ट / ब्लास्टोइड गठन के बाद) में मानव ब्लास्टोसिस्ट या ब्लास्टोइड्स को संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल की उप-इष्टतमता के कारण, हम यह आकलन करने में सक्षम नहीं हैं कि हम किस हद तक पोस्ट-इम्प्लांटेशन विकास को ठीक से मॉडल कर सकते हैं।
ब्लास्टोइड कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्टोमिक स्थिति का विश्लेषण आसानी से एससीआरएनएसेक, पर्याप्त संदर्भ मानचित्र और जैव सूचना विज्ञान विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। इससे पहले, ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि पीएक्सजीएल में सुसंस्कृत एचपीएससी प्राइमेड राज्य की तुलना में ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट के समान हैं। डेटा के विश्लेषण में सीमाएं तब हो सकती हैं जब संदर्भ मानचित्र में केवल ब्लास्टोसिस्ट-चरण कोशिकाएं शामिल हों। संदर्भ मानचित्र में संभावित ऑफ-टारगेट कोशिकाओं की उपस्थिति का आकलन करने के लिए पोस्ट-इम्प्लांटेशन भ्रूण से उत्पन्न कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए। भविष्य में, ब्लास्टोइड कोशिकाओं को बेंचमार्क करने के लिए, पूर्व और बाद के आरोपण मानव अवधारणा के सभी ऊतकों सहित एक संदर्भ मानचित्र बेहद मूल्यवान होगा। इसके अलावा, मल्टी-ओमिक्स एकल सेल संदर्भ मानचित्र, उदाहरण के लिए ट्रांसक्रिप्टोम, क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी और डीएनए मिथाइलेशन सहित, आगे मदद करेंगे। अंत में, भ्रूण मॉडल और संदर्भ अवधारणा से कोशिकाओं के बीच समानता का मात्रात्मक आकलन करने के लिए मानकीकृत जैव सूचना विज्ञान विधियों, और सकारात्मक रूप से ऑफ-टारगेट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आगे निष्पक्ष रूप से विश्लेषण और परिणामों की तुलना करने में मदद मिलेगी।
कुल मिलाकर, हिप्पो, टीजीएफ -β, और ईआरके मार्गों के ट्रिपल निषेध द्वारा गठित ब्लास्टोइड्स में 1) अत्यधिक कुशल मॉर्फोजेनेसिस, 2) वंश विनिर्देश का सही अनुक्रम, 3) ट्रांसक्रिप्टोम स्तर पर ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं की उच्च शुद्धता, 4) पेरी-इम्प्लांटेशन विकास को मॉडल करने की क्षमता की चार विशेषताएं हैं। ब्लास्टोइड्स की ये विशेषताएं ब्लास्टोसिस्ट विकास और आरोपण पर परिकल्पनाओं के निर्माण की सुविधा प्रदान करेंगी, हालांकि, वे भ्रूण के विकास के पहले चरणों को पुन: प्राप्त नहीं करते हैं। मानव ब्लास्टोसिस्ट की सीमित पहुंच और बहुमुखी प्रतिभा के विपरीत, ब्लास्टोइड्स ब्लास्टोसिस्ट विकास और आरोपण की कार्यात्मक जांच के लिए आनुवंशिक और दवा स्क्रीन के लिए उत्तरदायी हैं। भविष्य में, इस तरह के बुनियादी ज्ञान आईवीएफ मीडिया फॉर्मूलेशन में सुधार, निषेचन के बाद गर्भ निरोधकों को विकसित करने और प्रारंभिक गर्भावस्था के बेहतर प्रबंधन में योगदान दे सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ईआरसी-सह अनुदान समझौते संख्या 101002317 ‘ब्लास्टोइड: प्रारंभिक मानव भ्रूणजनन के लिए एक खोज मंच’) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है। एचएचके ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ), लिसे मेटनर प्रोग्राम एम 3131-बी द्वारा समर्थित है। हम एच 9 और एच 9-जीएफपी सेल लाइनों को साझा करने के लिए यासुहिरो ताकाशिमा और एचएनईएस 1, शेफ 6, एनआईपीएससी 16.2 बी और सीआर-एनसीआरएम 2 सेल लाइनों को साझा करने के लिए ऑस्टिन स्मिथ, पीटर एंड्रयूज और जीई गुओ को धन्यवाद देते हैं। एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स साझा करने के लिए हम हुसैन बहारवंद को धन्यवाद देते हैं। हम पीआरई विभेदित कोशिकाओं और एनईएनडी कोशिकाओं से अलग आरएनए साझा करने के लिए जोशुआ एम ब्रिकमैन को धन्यवाद देते हैं। हम पेरी-गैस्ट्रुलेशन भ्रूण के एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा को साझा करने के लिए शंकर श्रीनिवास को धन्यवाद देते हैं। हम SMARTSeq2 पुस्तकालय की तैयारी के लिए तकनीकी सहायता के लिए अलेक्सैंड बायकोव और लुइसा कोचेला को धन्यवाद देते हैं। हम महत्वपूर्ण सहायता के लिए आईएमबीए में एनजीएस, बायोऑप्टिक और स्टेम सेल सुविधा को धन्यवाद देते हैं।
Neurobasal media | in house | ||
DMEM/F12 | in house | ||
100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
1 M Hepes | in house | ||
50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
SC-144 | Axon | 2324 | |
XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
Matrigel | basement membrane matrix | ||
Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |