En protokol, der skitserer dannelsen af humane blastoider, der effektivt, rettidigt og sekventielt genererer blastocystlignende celler.
En model af den humane blastocyst dannet af stamceller (blastoid) ville understøtte videnskabelige og medicinske fremskridt. Imidlertid vil dens prædiktive kraft afhænge af dens evne til effektivt, rettidigt og trofast at rekapitulere sekvenserne af blastocystudvikling (morfogenese, specifikation, mønster) og til at danne celler, der afspejler blastocyststadiet. Her viser vi, at naive humane pluripotente stamceller dyrket under PXGL-forhold og derefter tredobbelt hæmmet for flodhesten, transformerende vækstfaktor- β og ekstracellulære signalregulerede kinaseveje effektivt gennemgår morfogenese for at danne blastoider (>70%). I overensstemmelse med udviklingstid (~ 4 dage) ruller blastoider blastocystsekvensen af specifikation ved at producere analoger af trofoblast og epiblast efterfulgt af dannelsen af analoger af den primitive endoderm og de polære trofoblaster. Dette resulterer i dannelsen af celler transkriptionelt svarende til blastocystet (>96%) og et mindretal af postimplantationsanaloger. Blastoider mønstrer effektivt ved at danne den embryonale-abembryoniske akse præget af modningen af polarområdet (NR2F2+), som erhverver det specifikke potentiale til retningsbestemt at binde sig til hormonelt stimulerede endometrieceller, som i utero. En sådan human blastoid er en skalerbar, alsidig og etisk model til at studere menneskelig udvikling og implantation in vitro.
Manglen på eksperimentelle modeller har begrænset forståelsen af tidlig human embryogenese. Den nuværende viden om menneskespecifikke aspekter af embryonal udvikling stammer fra overskydende embryoner til in vitro-befrugtning (IVF), der doneres til forskning. Den begrænsede tilgængelighed, vanskelighederne ved eksperimentelle manipulationer og embryonernes varierende kvalitet hindrer imidlertid videnskabelige undersøgelser. Tværtimod vil en trofast in vitro-model af menneskelige embryoner give mulighed for komplekse eksperimentelle manipulationer og dermed give en etisk mulighed for at supplere forskningen i menneskelige embryoner 1,2,3,4. En tidligere udviklet model af museeksplosyster kombinerede museembryonale stamceller og trofoblaststamceller5. I denne detaljerede protokol beskrives en metode til at generere en model af den humane blastocyst fra naive pluripotente stamceller, der er tro mod elementære blastocystkriterier, 6.
Fire kriterier for humane blastoider. Her, i et forsøg på at etablere en standardiseret definition af humane blastoider, foreslår vi fire minimale kriterier. Selv om disse kriterier ikke er udtømmende, kan de tjene som grundlag for at evaluere de parametre, der tillader dannelse af humane blastoider (figur 1A). (1) Blastoider bør dannes effektivt med hensyn til morfologi og generering af analogerne i de tre slægter, nemlig epiblast (Epi), trofektoderm (TE) og primitiv endoderm (PrE). Ineffektivitet vil sandsynligvis pege på en utilstrækkelig indledende celletilstand eller / og dyrkningstilstand (f.eks. Blastoidmedium). (2) Blastoider bør generere analoger af de tre slægter i henhold til udviklingssekvensen (Epi/TE først, PrE/polarTE sidst)7,8 og timing (induktion ~ 3 dage; embryonale dage 5-7)7,9. (3) Blastoider bør danne analoger af blastocyststadiet, men ikke af postimplantationsstadier (f.eks. epiblast, trofoblast eller amnionceller efter implantation). (4) Endelig bør blastoider være i stand til at rekapitulere funktionelle træk ved blastocystimplantation og -udvikling. Ved hjælp af denne protokol dannes humane blastoider effektivt ved hjælp af flere cellelinjer (>70%), er i stand til at generere blastocystcellulære analoger sekventielt og inden for 4 dage, og analogerne ligner transkriptionelt blastocyststadiet (>96% baseret på flere analyser)6,10,11. Endelig genererer blastoider robust den embryonale-abembryoniske akse, som gør det muligt for dem at interagere med hormonelt stimulerede endometrieceller gennem polarområdet og robust udvide slægterne ved udvidet kultur (tidsækvivalent: embryonal dag 13).
Betydningen af den oprindelige celletilstand. Humane pluripotente stamceller (hPSC’er) kan stabiliseres i forskellige tilstande, der forsøger at fange præcise udviklingsstadier. Disse tilstande opretholdes af dyrkningsbetingelser, der, selvom de stadig er suboptimale, begrænser celler i en præimplantations- (~ embryonale dage 5-7) eller postimplantationslignende (~ embryonale dage 8-14) epiblaststadium12. Transkriptomisk analyse viste, at hPSC’er dyrket i PD0325901, XAV939, Gö6983 og leukæmihæmmende faktor (LIF; betegnet PXGL naive hPSC’er)13,14 ligner mere blastocystepyblasten sammenlignet med hPSC’er dyrket i fibroblastvækstfaktor (FGF) 2 og activin15 (betegnet primede hPSC’er12) og til humane udvidede pluripotente stamceller (hEPSC’er)16 (se analyse i reference17, 18,19). Følgelig matcher transkriptomet af grundede hPSC’er bedst med en cynomolgus-abeepiblast efter implantation/præ-gastrulation20. Yderligere molekylære kriterier, som transposonekspression, DNA-methylering og X-kromosomtilstand, bekræftede, at variationer af den naive tilstand mere ligner blastocystepyblasten sammenlignet med den grundede tilstand17,21. Endelig er linjer af naive hPSC’er med succes blevet afledt direkte fra blastocysts ved hjælp af PXGL-kulturbetingelser22.
Humane tidlige blastocystceller er endnu ikke begået. Murine afstamningsspecifikation forekommer fra morula-stadiet, der går forud for blastocyststadiet23. Tværtimod har dissociations- og reaggregeringsforsøg vist, at de humane troftektodermceller fra tidlige blastocysts endnu ikke er begået24. Følgelig har analyse af cellerne i humane blastocysts ved enkeltcellet RNA-sekventering (scRNAseq) vist, at den første afstamningsspecifikation (trofoblast/epiblast) forekommer efter dannelsen af blastocysthulrummet7. Denne udskudte menneskelige specifikation korrelerer med observationer om, at hPSC’er er potente til at danne trofoblaster 25,26,27, når muse-PSC’er stort set er forpligtet til epiblast-slægten. Disse kombinerede observationer førte til muligheden for, at naive hPSC’er afspejler et blastocyststadium og bevarer potentialet til at danne de tre blastocyst-slægter. På det seneste er hPSC’ernes styrke til at specificere ekstraembryonale analoger blevet foreslået at skifte fra trophektoderm til amnion under progression fra naiv til primet tilstand27. Således ligner naive hPSC’er mere præimplantationstrinnet17,18,21 og har en forbedret kapacitet til at danne trofoblaster sammenlignet med primede hPSC’er27, hEPSC’er16 eller mellemliggende omprogrammerede tilstande28, som er tilbøjelige til at danne postimplantationsanaloger10 (figur 1B ). Den oprindelige celletilstand er således afgørende for dannelsen af de relevante ekstraembryonale analoger. Selvom der stadig mangler at blive foretaget en grundig side-om-side-analyse af konverterede trofektodermanaloger, synes en PXGL-naiv tilstand, der afspejler den tidlige blastocyst, vigtig for at danne blastoider med høj troskab.
Tilskyndelse til specifikation og morfogenese ved at signalere veje hæmning. Hæmningen af hippo-signalvejen er en bevaret mekanisme, der driver trofoblastspecifikation hos mus, køer og mennesker 9,29,30. Siden 2013 er det også kendt, at hæmningen af NODAL (A83-01) og den ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK; PD0325901 eller tilsvarende) og aktiveringen af knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalveje udløser primede hPSC’er for at aktivere transkriptionsnetværket forbundet med trofoblastafstrækken 25,31,32,33,34. Desuden bekræftede flere rapporter for nylig også, at hæmningen af både NODAL- og ERK-vejen og aktiveringen af BMP letter trofoblastdifferentieringen fra naive hPSC’er 25,31,32,33,34. Endelig, hvis trofoblastspecifikation udløses fra en naiv tilstand, rekapitulerer celler aspekter af trophektodermensudviklingsprogression 26. Imidlertid er selvfornyende linjer, der afspejler blastocysttropektodermen, ikke blevet stabiliseret in vitro. Efter trofoblastspecifikationen kan induktion af den epidermale vækstfaktor (EGF) og Wnt-signalveje sammen med HDAC-hæmning lette trofoblastudviklingsprogression34,35 og stabilisere celler i linjer af humane trofoblaststamceller (hTSC’er), der afspejler cytotrofoblaster efter implantation18,35. Sådanne linjer kan udledes både af blastocysts og placentavæv35.
Den anden ekstraembryonale slægt, betegnet PrE, er specificeret efter trofoblaster og stammer fra epiblasten 7,9. I modsætning til murine PrE36 menes den menneskelige modstykke at være uafhængig af FGF, der signalerer 37,38. Linjer, der afspejler den ekstraembryonale endoderm (nævnt nEnd), blev etableret fra naive hPSC’er ved induktion af signalveje ved hjælp af activin A, Wnt og LIF39. Uforenelig med embryohæmningsforsøg har ERK-hæmning vist sig at forhindre dannelsen af sådanne nEND-celler in vitro39. Indtil nu er sådanne linjer ikke afledt direkte fra blastocysts.
På det seneste er modeller af det tidlige embryo blevet dannet ved at kombinere variationer af de medier, der tidligere er udviklet til hTSCs35– og nEND-celler39, således ved hjælp af aktivatorer af den transformerende vækstfaktor – β (TGF-β), EGF og Wnt-signalveje28,40. Disse embryomodeller dannes ved lav effektivitet (10%-20%) og danner celler, der ligner post- snarere end præimplantationstrin10, herunder analoger af epiblasten efter implantation, trofoblast, amnion, gastrula, mesodermalt væv (~ embryonal dag 14) og cytotrophoblaster10. Tværtimod styrer en tredobbelt hæmning af Hippo-, ERK- og TGF-β-vejene effektivt dannelsen af blastoider, der omfatter blastocystlignende celler41. Sammen med den oprindelige celletilstand foreslår vi, at tredobbelt vejhæmning (Hippo, ERK, TGF-β) er den anden væsentlige parameter til dannelse af high-fidelity blastoider (figur 1B).
Evaluering af celletilstanden og det reflekterede stadium ved hjælp af scRNAseq. Tilstandene af celler, der komponerer blastoider, kan evalueres gennem scRNAseq-analyse. Deres transkriptionelle lighed med specifikke embryonale stadier kan måles ved hjælp af blastoidceller alene og ved sammenligning med primede hPSC’er eller hTSC’er, der afspejler postimplantationstrin20,35. Udførelse af klyngeanalyser ved hjælp af forskellige definitionsniveauer afslører, hvordan delpopulationer gradvist smelter sammen, når definitionen falder, hvilket afslører klyngernes ligheder. Selv om optimaliteten i antallet af klynger kan måles42, informerer højopløsningsklyngedannelse også om den eventuelle forekomst af små unormale delpopulationer, f.eks. afspejler postimplantationsfaserne10. De gener, der udtrykkes forskelligt mellem klynger, kan give information om deres analoger i udviklingsprocessen ved at vurdere ekspressionsniveauerne af referencegensæt, der definerer stadiespecifikke slægter. Dette gør det muligt at måle berigelsen af blastoidsubpopulationer enten ved hjælp af uovervågede afstandskort (f.eks. ved hjælp af topberigede gener) eller ved hjælp af gensætberigelsesanalyse (GSEA)43. Ved hjælp af denne blastoidprotokol dannes kun tre hovedklynger, der transkriptionelt afspejler de tre blastocyst-slægter. En klynge omfatter både de oprindelige naive hPSC’er og epiblastanalogen af blastoiderne. Analyse af celler på forskellige tidspunkter viste den sekventielle karakter af slægtsspecifikation (trofoblaster begynder at specificere inden for 24 timer og primitive endodermceller inden for 60 timer). En højopløsningsklynge fangede en underpopulation af celler (3,2%), der udtrykte gener, der er specifikke for embryoner i gastrulationsstadiet (muligvis mesoderm eller amnion). Det bemærkes, at de oprindelige naive hPSC’er også omfattede 5% af postimplantationslignende celler, som tidligere beskrevet44. I en anden analyse kan blastoidceller fusioneres i silico med referenceceller isoleret fra concepti på forskellige stadier 45,46,47 for at udlede stadieækvivalens. Her blev celler isoleret fra præimplantationskoncepti45,46, in vitro-dyrkede blastocyster45 og embryoner i gastrulationsstadi47 anvendt som referencepunkter. Ved hjælp af denne protokol blev det kvantificeret, at de uoverensstemmende blastoidceller afsløret ved højopløsningsklynger faktisk klynger med postimplantationsmesoderm og amnion. I fremtidige trin bør transkriptombenchmarking suppleres med analyse af transposonekspression, DNA-methylering og af X-kromosomstatus, der også giver milepæle for udviklingsstadier21.
Evaluering af aksedannelse og andre funktioner af humane blastoider. En moden blastocyst er kendetegnet ved dannelsen af de embryonale-abembryoniske aksemønstrende trofoblaster til implantation. Ved hjælp af denne blastoidprotokol dannes en akse robust eksemplificeret ved en modning af de proksimale trofoblaster (f.eks. NR2F2 +/CDX2-), der kun opnår evnen til at binde sig til endometrieorganoidceller, når de er hormonelt stimulerede48,49. Sammenligning med trofosfærer, der ikke danner epiblasten, viser, at disse indre celler inducerer tilstødende trofoblaster til at modnes for at formidle den oprindelige vedhæftning til endometrium. Når de dyrkes i et udvidet kulturmedium designet til cynomolgus abeblastocysts50, udvides alle tre slægter fra blastoiden konsekvent i yderligere seks dage (tidsækvivalent til dag 13), selvom deres organisation ikke afspejler dette udviklingsstadium.
Implikationen af højeffektive og high-fidelity humane blastoider. Bevarelsen af udviklingsprincipper, der blev opdaget i modelorganismer, er i sagens natur vanskelig at teste i det menneskelige koncept på grund af den begrænsede adgang og de tekniske vanskeligheder ved genetisk og fysisk at manipulere det. En højeffektiv blastoidmodel med høj nøjagtighed vil give mulighed for genetiske og lægemiddelscreeninger med høj kapacitet, som er grundlaget for videnskabelige og biomedicinske opdagelser. Desuden vil inkorporeringen af komplekse genetiske modifikationer for at ændre og registrere biologiske processer supplere sådanne undersøgelser. Samlet set foreslår vi, at den tredobbelte hæmning (Hippo, TGF-β, ERK) af naive PXGL hPSC’er er ledende for effektiv dannelse af humane blastoider med høj troskab, der overholder de fire minimale kriterier. Den skalerbare og alsidige karakter af denne protokol gør den velegnet til at generere målrettede hypoteser, der derefter kan valideres ved hjælp af humane blastocysts. Som sådan vil humane blastoider ikke erstatte brugen af human conceptus til in vitro-forskning , men kan fungere som en stærk måde at kanalisere forskning gennem tidligere utilgængelige eksperimentelle tilgange i hjertet af den videnskabelige og biomedicinske opdagelsesproces. Protokollen viser, hvordan man danner humane blastoider, og også hvordan man analyserer de celler, der er indeholdt i blastoiden.
I denne undersøgelse viser vi trin for trin, hvordan man etablerer humane blastoider med høj effektivitet ved hjælp af en enkel og robust protokol. Ved aggregering af naive PXGL hPSC’er og deres tredobbelte hæmning dannes blastoider effektivt (> 70%) og genererer sekventielt de 3 blastocystanaloger inden for 4 dage. Begrænsninger i blastoidernes effektivitet og kvalitet (f.eks. Tilstedeværelsen af celler uden for målet) kan forekomme, hvis den oprindelige tilstand er suboptimal. Bemærk, at vi har målt, at PXGL hPSC’er indeholder ca. 5% af cellerne, der afspejler postimplantationsstadierne. Disse celler kan begrænse dannelsen af blastoider af høj kvalitet. Ud over den oprindelige naive PXGL-tilstand, der afspejler blastocystepyblasten, er en anden afgørende faktor det medium, der anvendes til blastoiddannelse. For hurtigt at danne blastocystlignende celler og forhindre dannelsen af off-target, postimplantationslignende celler foreslår vi, at tredobbelt vejhæmning (Hippo, ERK, TGF-β) er afgørende. Mens forskellige cellelinjer giver forskellige udbytter af blastoid ved ERK / TGF-β hæmning (generelt omkring 10% -20%), resulterer eksponering for LPA i dannelsen af lige så højt blastoidudbytte på tværs af alle cellelinjer, samtidig med at der anvendes strenge morfometriske og afstamningsspecifikationskriterier. LPA virker muligvis på hæmningen af hippovejen, som spiller en kritisk rolle i den første slægtsadskillelse mellem epiblast- og troctoderm-slægter hos mus oghumane 8,51. Den signifikante forbedring af blastoideffektiviteten ved LPA tyder på, at hippovejsmedierede indre-ydre cellespecifikationsmekanismer, der er på spil i blastocysten, koopterer under blastoiddannelsen. En nuværende begrænsning ligger i, at vi på grund af en suboptimalitet af de protokoller, der anvendes til dyrkning af human blastocyst eller blastoider på tidsækvivalent dag 7-13 (efter blastocyst/blastoiddannelse), ikke er i stand til at vurdere, i hvilket omfang vi korrekt kan modellere udviklingen efter implantationen.
Analyse af blastoidcellernes transkriptomiske tilstand kan let opnås ved hjælp af scRNAseq, passende referencekort og bioinformatiske metoder. Tidligere viste den transkriptomiske analyse, at hPSC’er dyrket i PXGL ligner mere blastocystepyblasten sammenlignet med den primede tilstand. Der kan forekomme begrænsninger i analysen af dataene, hvis referencekortet kun omfatter blastocyst-stadieceller. Referencekortet bør omfatte celler, der stammer fra embryoner efter implantation, med henblik på at vurdere tilstedeværelsen af potentielle celler uden for målgruppen. For at benchmarke blastoidceller vil et referencekort, der omfatter alle væv fra det humane koncept før og efter implantationen, i fremtiden være yderst værdifuldt. Derudover vil multi-omics enkeltcellereferencekort, for eksempel inklusive transkriptom, kromatintilgængelighed og DNA-methylering, yderligere hjælpe. Endelig vil standardiserede bioinformatiske metoder til kvantitativt at vurdere lighederne mellem celler fra embryomodeller og referencekoncepter og til positivt at identificere off-target-celler yderligere bidrage til upartisk at analysere og sammenligne resultater.
Alt i alt besidder blastoider dannet ved tredobbelt hæmning af Hippo-, TGF-β- og ERK-veje de fire egenskaber ved 1) højeffektiv morfogenese, 2) korrekt sekvens af afstamningsspecifikation, 3) høj renhed af blastocystlignende celler på transkriptomniveau, 4) kapacitet til at modellere periimplantationsudvikling. Disse egenskaber ved blastoider vil lette opbygningen af hypoteser om blastocystudvikling og implantation, men de rekapitulerer ikke tidligere stadier af embryonal udvikling. I modsætning til den begrænsede tilgængelighed og alsidighed af human blastocyst er blastoider modtagelige for genetiske og lægemiddelskærme til funktionelle undersøgelser af blastocystudvikling og implantation. I fremtiden kan en sådan grundlæggende viden bidrage til at forbedre IVF-medieformulering, udvikle præventionsmidler efter befrugtning og bedre styre tidlig graviditet.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (EFR) under EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (ERC-Co-tilskudsaftale nr. 101002317 ‘BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis’). H.H.K. er støttet af den østrigske videnskabsfond (FWF), Lise Meitner-programmet M3131-B. Vi takker Yasuhiro Takashima for at dele H9- og H9-GFP-cellelinjerne og Austin Smith, Peter Andrews og Ge Guo for at dele HNES1-, Shef6-, niPSC 16.2b- og cR-NCRM2-cellelinjerne. Vi takker Hossein Baharvand for at dele endometrieorganoiderne. Vi takker Joshua M. Brickman for at dele RNA isoleret fra PrE-differentierede celler og nEND-celler. Vi takker Shankar Srinivas for at dele de encellede RNA-sekventeringsdata for peri-gastrulationsembryoet. Vi takker Aleksand Bykov og Luisa Cochella for teknisk assistance til SMARTSeq2 biblioteksforberedelse. Vi takker NGS-, biooptik- og stamcellefaciliteten på IMBA for kritisk hjælp.
Neurobasal media | in house | ||
DMEM/F12 | in house | ||
100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
1 M Hepes | in house | ||
50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
SC-144 | Axon | 2324 | |
XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
Matrigel | basement membrane matrix | ||
Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |