Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi
Summary
Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi’yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti’ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.
Abstract
Strongyloides cinsi, Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti dahil olmak üzere farklı konakçı aralıklarına sahip çok sayıda cilde nüfuz eden nematod türünden oluşur. S. stercoralis yaklaşık 610 milyon insanı enfekte eden insan-parazitik, cilde nüfuz eden bir nematoddur, sıçan paraziti S. ratti ise S. stercoralis ile yakından ilişkilidir ve genellikle S. stercoralis için bir laboratuvar modeli olarak kullanılır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti, intragonadal mikroenjeksiyonun eksojen nükleik asit dağıtım tekniği ile transgenik ve nakavt oluşumuna kolayca uygundur ve bu nedenle, henüz bu tekniğe uygun olmayan diğer parazitik helmintler için model sistemler olarak ortaya çıkmıştır.
Paraziter Strongyloides yetişkinleri, konakçılarının ince bağırsağında yaşar ve dışkı yoluyla çevreye soy salgılarlar. Çevreye girdikten sonra, larvalar dışkıda yaşayan ve yeni bir konakçı bulması ve istila etmesi gereken soy üreten serbest yaşayan yetişkinlere dönüşür. Bu çevresel nesil, Strongyloides türlerine özgüdür ve morfolojide, C. elegans için geliştirilen tekniklerin, intragonadal mikroenjeksiyon da dahil olmak üzere bu parazitik nematodlarla kullanım için uyarlanabileceği serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans modeline yeterince benzer. İntragonadal mikroenjeksiyon kullanılarak, Strongyloides’e çok çeşitli transgenler sokulabilir. CRISPR / Cas9 bileşenleri ayrıca mutant Strongyloides larvaları oluşturmak için mikroenjekte edilebilir. Burada, serbest yaşayan yetişkinlerin hazırlanması, enjeksiyon prosedürü ve transgenik döl seçimi de dahil olmak üzere Strongyloides’e intragonadal mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mutagenezi kullanılarak oluşturulan transgenik Strongyloides larvalarının görüntüleri dahil edilmiştir. Bu makalenin amacı, diğer araştırmacıların transgenik ve mutant Strongyloides oluşturmak için mikroenjeksiyon kullanmalarını sağlamaktır.
Introduction
Strongyloides stercoralis uzun zamandır daha yaygın olarak tanınan kancalı kurtlara ve yuvarlak kurt Ascaris lumbricoides1’e kıyasla önemli bir insan patojeni olarak göz ardı edilmiştir. Solucan yükü ile ilgili önceki çalışmalar, S. stercoralis 2 için yaygın tanı yöntemlerinin düşük duyarlılığı nedeniyle S. stercoralis prevalansını sıklıkla ciddi şekilde hafife almıştır. Son yıllarda, gelişmiş tanı araçlarına dayanan epidemiyolojik çalışmalar, S. stercoralis enfeksiyonlarının gerçek prevalansının daha önce bildirilenden çok daha yüksek olduğunu, dünya çapında yaklaşık 610 milyon insanın2 olduğunu tahmin etmektedir.
Hem S. stercoralis hem de yakından ilişkili sıçan paraziti ve ortak laboratuvar modeli S. ratti de dahil olmak üzere diğer Strongyloides türleri, deneysel genomik çalışmalar için avantajlı olan alışılmadık bir yaşam döngüsüne sahiptir, çünkü hem parazitik hem de serbest yaşayan (çevresel) nesillerden oluşur3 (Şekil 1). Spesifik olarak, hem S. stercoralis hem de S. ratti, tek bir serbest yaşayan nesil boyunca döngü yapabilir. Serbest yaşayan nesil, serbest yaşayan yetişkin erkek ve dişilere dönüşen parazit sonrası larvalardan oluşur; Serbest yaşayan yetişkinlerin tüm soyları, yaşam döngüsüne devam etmek için bir konağı enfekte etmesi gereken enfektif larvalara dönüşür. Ayrıca, bu çevresel veya serbest yaşayan nesil laboratuvarda deneysel olarak manipüle edilebilir. Serbest yaşayan Strongyloides yetişkinleri ve C. elegans yetişkinleri benzer morfolojiyi paylaştığından, başlangıçta C. elegans için geliştirilen intragonadal mikroenjeksiyon gibi teknikler, serbest yaşayan yetişkin Strongyloides 4,5 ile kullanım için uyarlanabilir. DNA genellikle serbest yaşayan yetişkin kadınlara sokulmuş olsa da, Strongyloides’in hem erkekleri hem de dişileri mikroenjekte edilebilir6. Bu nedenle, Strongyloides’in biyolojisinin birçok yönünü sorgulamak için fonksiyonel genomik araçlar mevcuttur. Diğer paraziter nematodlar serbest yaşayan bir nesilden yoksundur ve sonuç olarak, fonksiyonel genomik tekniklere kolayca uygun değildir3.
Resim 1: Strongyloides stercoralis yaşam döngüsü. S. stercoralis parazitik dişileri, memeli konakçılarının (insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler) ince bağırsağında yaşar. Paraziter dişiler partenogenez ile çoğalır ve ince bağırsakta yumurta bırakır. Yumurtalar hala konakçının içindeyken parazit sonrası larvalara yumurtadan çıkar ve bunlar daha sonra dışkı ile çevreye geçirilir. Post-paraziter larvalar erkekse, serbest yaşayan yetişkin erkeklere dönüşürler. Post-paraziter larvalar dişi ise, serbest yaşayan yetişkin dişilere (dolaylı gelişim) veya üçüncü aşama enfektif larvalara (iL3’ler; doğrudan gelişim) dönüşebilirler. Serbest yaşayan erkekler ve dişiler, iL3’ler haline gelmek için kısıtlanmış soylar oluşturmak için cinsel olarak çoğalırlar. Belirli koşullar altında, S. stercoralis ayrıca parazit sonrası larvaların bir kısmının dışkıda çevreye geçmek yerine konakçı bağırsağın içinde kaldığı otoenfeksiyona da maruz kalabilir. Bu larvalar, konakçının içinde otoenfektif larvalara (L3a) dönüşebilir, bağırsak duvarından nüfuz edebilir, vücuttan göç edebilir ve sonunda üreme yetişkinleri olmak için bağırsağa geri dönebilir. S. ratti’nin yaşam döngüsü benzerdir, ancak S. ratti sıçanları enfekte eder ve otoenfektif bir döngüye sahip değildir. Çevresel üretim, genetik çalışmalar için Strongyloides türlerini kullanmanın anahtarıdır. Serbest yaşayan yetişkin dişiler (P0) mikroenjekte edilebilir; hepsi iL3’ler haline gelecek olan soyları, potansiyelF1 transgenikleridir. Bu rakam Castelletto ve ark.’dan değiştirilmiştir. 3. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
S. stercoralis biyolojisinin birçok yönünü konakçı istilası ve konakçı immün modülasyonu dahil olmak üzere diğer gastrointestinal insan-paraziter nematodlarla paylaşır. Örneğin, Necator ve Ancylostoma cinslerindeki insan-parazitik kancalı kurtlar da cilt penetrasyonu ile enfekte olur, vücutta benzer şekilde gezinir ve sonuçta ince bağırsakta parazitik yetişkinler olarak bulunur7. Bu nedenle, birçok gastrointestinal nematod muhtemelen ortak duyusal davranışları ve immün kaçınma tekniklerini kullanır. Sonuç olarak, Strongyloides’ten toplanan bilgiler, genetik olarak daha az izlenebilir diğer nematodlardaki bulguları tamamlayacak ve bu karmaşık ve önemli parazitlerin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır.
Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenik ve mutant döl yapmak için DNA’yı Strongyloides serbest yaşayan yetişkin dişilere sokma yöntemini özetlemektedir. Mikroenjeksiyonlar için yetişkin solucanların gelişimsel zamanlaması ve transgenik söllerin toplanması da dahil olmak üzere suş bakım gereksinimleri açıklanmaktadır. Protokoller ve tüm mikroenjeksiyon tekniğinin bir gösterimi, transgenik söllerin kültürlenmesi ve taranması için protokollerle birlikte, gerekli tüm ekipman ve sarf malzemelerinin bir listesi ile birlikte dahil edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenez ve CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez için yapıları S. stercoralis ve S. ratti’ye tanıtma yöntemlerini detaylandırır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti için, enjeksiyon sonrası sağkalım ve transgenez veya mutajenez oranı, ince ayar yapılabilen çeşitli değişkenlere tabidir.
Başarılı transgenez için ilk kritik düşünce, plazmid transgenlerinin nasıl oluşturulduğudur. Önceki çalışmalar, St…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pPV540 ve pPV402, Pennsylvania Üniversitesi’nden Dr. James Lok’un nazik hediyeleriydi. Astra Bryant’a makale hakkındaki yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hastalığın Patogenezinde Burroughs-Wellcome Fonu Araştırmacıları Ödülü, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fakülte Bursiyeri Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DC017959 (E.A.H.) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
Referenzen
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5′-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetik. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetik. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
