Summary

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג’קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג’נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו – S. ratti.

Abstract

הסוג סטרונגילואידים מורכב ממספר מינים של נמטודות חודרות עור עם טווחי פונדקאים שונים, כולל סטרונגילואידים סטרקורליס ו-סטרונגילואידים ראטי. S. stercoralis הוא נמטודה אנושית-טפילית וחודרת עור המדביקה כ-610 מיליון בני אדם, בעוד שטפיל החולדה S. ratti קשור קשר הדוק ל-S. stercoralis ומשמש לעתים קרובות כמודל מעבדה עבור S. stercoralis. גם S. stercoralis וגם S. ratti ניתנים להתאמה בקלות ליצירת טרנסגניות ונוקאאוטים באמצעות טכניקת העברת חומצות גרעין אקסוגניות של מיקרו-איניג’קציה תוך-גונדלית, וככאלה, הופיעו כמערכות מודל להלמינתנים טפיליים אחרים שעדיין אינם מקובלים על טכניקה זו.

בוגרים טפיליים של סטרונגילואידים מאכלסים את המעי הדק של הפונדקאי שלהם ומשחררים צאצאים לסביבה דרך הצואה. ברגע שהם נמצאים בסביבה, הזחלים מתפתחים לבוגרים חופשיים, שחיים בצואה ומייצרים צאצאים שחייבים למצוא פונדקאי חדש ולטלוש אליו. דור סביבתי זה הוא ייחודי למין סטרונגילואידים ודומה מספיק במורפולוגיה למודל של נמטודה חופשית Caenorhabditis elegans שניתן להתאים טכניקות שפותחו עבור C. elegans לשימוש עם נמטודות טפיליות אלה, כולל מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית. באמצעות מיקרו-איניג’ינג תוך-גונדלי, ניתן להכניס מגוון רחב של טרנסג’נדרים ל-Strongyloides. רכיבי CRISPR/Cas9 יכולים גם להיות מיקרו-איניג’קטים כדי ליצור זחלי סטרונגילואידים מוטנטיים. כאן מתוארת הטכניקה של מיקרו-איניג’קציה תוך-גונדלית לתוך סטרונגילואידים, כולל הכנת מבוגרים החיים בחופשיות, הליך ההזרקה ובחירת הצאצאים המהונדסים. תמונות של זחלי סטרונגילואידים מהונדסים שנוצרו באמצעות מוטגנזה של CRISPR/Cas9 כלולות. מטרת מאמר זה היא לאפשר לחוקרים אחרים להשתמש במיקרו-איניג’קציה כדי ליצור סטרונגילואידים מהונדסים ומוטנטיים.

Introduction

סטרקוראליס סטרקורליס סטרונגילואידס כבר מזמן התעלמו ממנו כפתוגן אנושי חשוב בהשוואה לתולעי הקרס המוכרות יותר ולתולעת העגולה Ascaris lumbricoides1. מחקרים קודמים על נטל התולעים לעתים קרובות העריכו באופן חמור את השכיחות של S. stercoralis בשל הרגישות הנמוכה של שיטות אבחון נפוצות עבור S. stercoralis2. בשנים האחרונות, מחקרים אפידמיולוגיים המבוססים על כלי אבחון משופרים העריכו כי השכיחות האמיתית של זיהומי S. stercoralis גבוהה בהרבה ממה שדווח בעבר, כ -610 מיליון אנשים ברחבי העולם2.

גם ל-S. stercoralis וגם למינים אחרים של סטרונגילואידים, כולל טפיל החולדה הקשור באופן הדוק ולמודל המעבדה הנפוץ S. ratti, יש מחזור חיים יוצא דופן שיש לו יתרון למחקרים גנומיים ניסיוניים מכיוון שהוא מורכב מדורות טפיליים וחופשיים (סביבתיים)3 (איור 1). באופן ספציפי, גם S. stercoralis וגם S. ratti יכולים לעבור דרך דור אחד של חיים חופשיים. הדור החי החופשי מורכב מזחלים פוסט-טפיליים המתפתחים לזכרים ונקבות בוגרים בעלי חיים חופשיים; כל צאצאיהם של הבוגרים החיים בחופשיות מתפתחים לזחלים מדביקים, אשר חייבים להדביק פונדקאי כדי להמשיך את מחזור החיים. יתר על כן, ניתן לתמרן באופן ניסיוני את הדור הסביבתי או החופשי הזה במעבדה. מאחר שמבוגרים בעלי חיים חופשיים של סטרונגילואידים ובוגרים של C. elegans חולקים מורפולוגיה דומה, ניתן להתאים טכניקות כגון מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית שפותחו במקור עבור C. elegans לשימוש עם סטרונגילואידים בוגרים חיים חופשיים 4,5. בעוד שדנ”א מוחדר בדרך כלל לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים, גם זכרים וגם נקבות של סטרונגילואידים יכולים להיות מיקרו-איניג’קט6. לפיכך, כלים גנומיים פונקציונליים זמינים כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה של סטרונגילואידים. נמטודות טפיליות אחרות חסרות דור חופשי, וכתוצאה מכך, הן אינן מקובלות באותה מידה על טכניקות גנומיות פונקציונליות3.

Figure 1
איור 1: מחזור החיים של סטרקורליס סטרונגילואידים. הנקבות הטפיליות של S. stercoralis מאכלסות את המעי הדק של מארחי היונקים שלהן (בני אדם, פרימטים שאינם בני אדם, כלבים). הנקבות הטפיליות מתרבות על ידי פרתנוגנזה ומטילות ביצים בתוך המעי הדק. הביצים בוקעות בעודן בתוך הפונדקאי לתוך זחלים פוסט-טפיליים, אשר מועברים לסביבה עם צואה. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם זכרים, הם מתפתחים לזכרים בוגרים שחיים בחופשיות. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם נקבות, הם יכולים להתפתח לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים (התפתחות עקיפה) או לזחלים זיהומיים בשלב השלישי (iL3s; התפתחות ישירה). הזכרים והנקבות החיים בחופשיות מתרבים מינית כדי ליצור צאצאים המוגבלים להפוך ל-iL3s. בתנאים מסוימים, S. stercoralis יכול גם לעבור הדבקה אוטומטית, שבה חלק מהזחלים הפוסט-טפיליים נשארים בתוך המעי המארח במקום לעבור לסביבה בצואה. זחלים אלה יכולים להתפתח לזחלים אוטו-אינפקטיביים (L3a) בתוך הפונדקאי, לחדור דרך דופן המעי, לנדוד דרך הגוף, ובסופו של דבר לחזור למעי כדי להפוך למבוגרים רבייתיים. מחזור החיים של S. ratti דומה, למעט העובדה ש– S. ratti מדביק חולדות ואין לו מחזור אוטו-אינפקטיבי. הדור הסביבתי הוא המפתח לשימוש במיני סטרונגילואידים למחקרים גנטיים. הנקבות הבוגרות החיות באופן חופשי (P0) יכולות להיות מיקרו-איניג’קט; צאצאיהם, שכולם יהפכו ל-iL3s, הם המהונדסים הפוטנציאליים של F1. נתון זה שונה מקסטלטו ואחרים. 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

S. stercoralis חולק היבטים רבים של הביולוגיה שלו עם נמטודות אנושיות-טפיליות אחרות במערכת העיכול, כולל פלישת המארחים ומודולציה של מערכת החיסון המארח. לדוגמה, תולעי קרס אנושיות-טפיליות בסוג Necator ו – Ancylostoma גם נדבקות על ידי חדירת העור, מנווטות באופן דומה בגוף, ובסופו של דבר שוכנות כבוגרים טפיליים במעי הדק7. לפיכך, נמטודות רבות במערכת העיכול ככל הנראה משתמשות בהתנהגויות חושיות נפוצות ובטכניקות התחמקות חיסוניות. כתוצאה מכך, הידע שנאסף מ-Strongyloides ישלים את הממצאים בנמטודות אחרות, שפחות ניתנות לטיפול גנטי, ויוביל להבנה מלאה יותר של הטפילים המורכבים והחשובים האלה.

פרוטוקול מיקרו-איניג’קציה זה מתווה את השיטה להחדרת דנ”א לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים של סטרונגילואידים כדי ליצור צאצאים מהונדסים ומוטנטיים. מתוארות דרישות תחזוקת המתח, כולל התזמון ההתפתחותי של תולעים בוגרות למיקרו-אינטגרציות ואיסוף צאצאים מהונדסים. פרוטוקולים והדגמה של טכניקת המיקרו-איניג’קציה המלאה, יחד עם פרוטוקולים לגידול וסינון צאצאים מהונדסים, כלולים, יחד עם רשימה של כל הציוד הדרוש וחומרים מתכלים.

Protocol

הערה: גרבילים שימשו למעבר S. stercoralis, וחולדות שימשו למעבר S. ratti. כל ההליכים אושרו על ידי המשרד לפיקוח על מחקר בעלי חיים של UCLA (פרוטוקול מס ‘2011-060-21A), העומד בתקני AAALAC ובמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. את המשימות הבאות יש להשלים לפחות יום אחד לפני המיקרו-איניג’קטינג’ינג: גידול תולעים, הכנ…

Representative Results

אם הניסוי היה מוצלח, הזחלים F1 יבטאו את הפנוטיפ הטרנסגני ו/או המוטנטי המעניין (איור 4). עם זאת, שיעורי הטרנספורמציה משתנים מאוד ותלויים במבנים, בבריאות התולעים, בתנאי התרבות שלאחר ההזרקה ובמיומנות של הנסיין. באופן כללי, ניסוי מוצלח יניב זחלים >15 F 1 לכל נקבה מוזרקת ו…

Discussion

פרוטוקול מיקרו-איניג’קציה זה מפרט את השיטות להחדרת מבנים לטרנסגנזה ומוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 לתוך S. stercoralis ו-S. ratti. הן עבור S. stercoralis והן עבור S. ratti, ההישרדות לאחר ההזרקה ושיעור הטרנסגנזה או המוטגנזה כפופים למספר משתנים הניתנים לכוונון עדין.

השיקול הקריטי הראש…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

pPV540 ו- pPV402 היו מתנות חביבות מד”ר ג’יימס לוק מאוניברסיטת פנסילבניה. אנו מודים לאסטרה בראיינט על הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי חוקרי קרן בורוז-וולקום בפרס הפתוגנזה של מחלות, פרס חוקר הפקולטה של המכון הרפואי ע”ש הווארד יוז, והמכונים הלאומיים לבריאות R01 DC017959 (E.A.H.).

Materials

(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid Sigma-Aldrich N3876-5ML nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) VWR 470121-790 C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE Phenix RBA-500 agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh Ebonex n/a charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh Reade bonechar10x28 charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator Narishige MMN-1 coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Fisher 07-200-385 microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness Brain Research Lab 4860-1 coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter VWR 82050-918 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod Fisher 12-000-101 stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips VWR 89009-310 for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads Fisher 14-206-62 bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings Fisher 14-050CQ Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe McMaster-Carr 7541A51 glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-50ML halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD McMaster-Carr 3038K24 tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase VWR 89001-414 Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors Fisher 15-235-101 bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence Leica M165 FC GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder Tritech MINJ-4 microinjection needle holder
microINJECTOR system Tritech MINJ-1 microinjection system
Mongolian Gerbils Charles River Laboratories 213-Mongolian Gerbil gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz VWR 11216-776 Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh) Jo-Ann Fabrics zprd_14061949a nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch Thomas Scientific 1233S72 platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) VWR 62505-007 wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans Envigo 140 HsdBlu:LE Long Evans rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley Envigo 002 Hsd:Sprague Dawley SD rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" Office Depot 452369 plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches Newco 999589 techboard
Stainless steel raised wire floor Ancare R20SSRWF wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 Office Depot 9587303 spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm Carolina (Science) 741012 watch glasses (small, round)
Stereomicroscope Motic K-400 LED dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite Grainger 53GN16 plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller Sutter P-30/P needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses Fisher S34826 watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps Fisher 05-769-2Q funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator Narishige MM0-4 fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps Fisher S99422 Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) Tritech Research T3308P 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers VWR 82003-820 lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in Carolina (Science) 742300 watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter Fisher 09-805B filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter Fisher 09-805D filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in Fisher 50-821-813 glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade Office Depot 238816 X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1 Zeiss n/a inverted microscope

Referenzen

  1. Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
  2. Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
  3. Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, 206482 (2020).
  4. Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  5. Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , (2013).
  6. Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
  7. Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  9. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
  10. Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
  11. Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
  12. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  13. Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
  14. Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
  15. Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
  16. Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
  17. Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
  18. Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
  19. Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
  20. Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
  21. Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5′-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
  22. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetik. 216 (4), 947-956 (2020).
  23. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
  24. Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
  25. Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
  26. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
  27. Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
  28. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetik. 199 (4), 959-971 (2015).
  29. Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
  30. Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
  31. Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
  32. Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
  33. Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
  34. Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
  35. Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Castelletto, M. L., Hallem, E. A. Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection. J. Vis. Exp. (176), e63023, doi:10.3791/63023 (2021).

View Video