Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Het modelleren van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het laboratorium wordt uniek uitdagend gemaakt vanwege de overweldigend sporadische aard van meer dan 80% van de ^gevallen1, in combinatie met het enorme aantal genetische mutaties waarvan bekend is dat ze ziekteveroorzakend ^zijn2. Desondanks delen alle gevallen van ALS het verenigende kenmerk dat er vóór regelrechte neuronale degeneratie disfunctionele communicatie is tussen presynaptische motorneuronen en postsynaptische ^{spiercellen3,4}. Klinisch gezien, als patiënten de connectiviteit van de resterende bovenste en onderste motorneuronen verliezen, presenteren ze zich met kenmerken van neuronale hyper- en hypoexcitabiliteit gedurende de ziekte5,6,7,8,9, als gevolg van complexe onderliggende moleculaire veranderingen in deze synapsen, die wij, als ALS-onderzoekers, proberen te begrijpen.

Meerdere transgene modellen hebben aangetoond dat verslechtering en desorganisatie van de neuromusculaire junctie optreden met de expressie van ALS-oorzakelijke genetische mutaties, waaronder ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 en TDP4317,18,19 door morfologische beoordelingen, waaronder evaluatie van synaptische boutons, wervelkolomdichtheden en pre / postsynaptische organisatie. Mechanistisch gezien, sinds de baanbrekende artikelen van Cole, Hodgkin en Huxley in de jaren 1930, is het ook mogelijk geweest om synaptische reacties te evalueren door middel van elektrofysiologische technieken in in vitro celkweek of weefselschijfpreparaten20. Door deze strategieën hebben veel modellen van ALS synaptische transmissietekorten aangetoond. Een gemuteerde variant van TDP43 veroorzaakt bijvoorbeeld een verhoogde vuurfrequentie en verlaagt de actiepotentiaaldrempel in NSC-34 (ruggenmerg x neuroblastoom hybride cellijn 34) motorneuronachtige ^cellen21. Deze zelfde variant veroorzaakt ook disfunctionele synaptische transmissie op de neuromusculaire junctie (NMJ) vóór het begin van gedragsmotorische tekorten in een ^muismodel22. Eerder werd aangetoond dat mutante FUS-expressie resulteert in verminderde synaptische transmissie bij de NMJ in een drosophila-model van FUS-ALS vóór locomotorische ^defecten11. Een recent rapport met geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van C9orf72-expansiedragers onthulde een vermindering van de gemakkelijk vrij te geven pool van synaptische ^blaasjes23. Al met al benadrukken deze studies en andere het belang van het opbouwen van een uitgebreider begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische signalering in ziekterelevante modellen van ALS. Dit zal cruciaal zijn in het begrijpen van de pathobiologie van ALS en het ontwikkelen van potentiële therapeutische doelen voor patiënten.

Methoden van stroom- en spanningsklemcellen zijn van onschatbare waarde geweest bij het bepalen van membraaneigenschappen zoals geleiding, rustmembraanpotentiaal en kwantitatief gehalte van individuele synapsen20,24. Een van de belangrijkste beperkingen van elektrofysiologie is echter dat het technisch uitdagend is en slechts inzichten biedt van een enkel neuron tegelijk. Live-cell confocale microscopie, gekoppeld aan specifieke fluorescerende probes, biedt de mogelijkheid om de synaptische transmissie van neuronen op een spatiotemporale manier te onderzoeken25,26,27. Hoewel het geen directe maat is voor neuronale prikkelbaarheid, kan deze fluorescentiebenadering een relatieve meting bieden van twee moleculaire correlaties van synaptische functie: synaptische blaasjesafgifte en calciumtransiënten op synaptische terminals.

Wanneer een actiepotentiaal het presynaptische terminale gebied van neuronen bereikt, worden calciumtransiënten geactiveerd, waardoor de overgang van een elektrisch signaal naar het proces van afgifte van neurotransmitters ^{wordt vergemakkelijkt28}. Spanningsafhankelijke calciumkanalen gelokaliseerd in deze gebieden reguleren de calciumsignalering strak om de kinetiek van de afgifte van neurotransmitters te ^moduleren29. De eerste gerapporteerde fluorescentie-gebaseerde opnames van calciumtransiënten werden uitgevoerd met behulp van de dual-golflengte indicator Fura-2 AM of de single golflengte kleurstof Fluo-3 AM30,31,32. Hoewel deze kleurstoffen destijds veel nieuw inzicht boden, lijden ze aan verschillende beperkingen, zoals niet-specifieke compartimentering in cellen, actief of passief kleurstofverlies van gelabelde cellen, fotobleeken en toxiciteit als ze gedurende langere tijd worden ^afgebeeld33. In het afgelopen decennium zijn genetisch gecodeerde calciumindicatoren de werkpaarden geworden voor het in beeld brengen van verschillende vormen van neuronale activiteit. Deze indicatoren combineren een gemodificeerd fluorescerend eiwit met een calciumchelatoreiwit dat snel van fluorescentie-intensiteit wisselt na de binding van ^{Ca2+ ionen34}. De toepassing van deze nieuwe indicatoren is enorm, waardoor een veel eenvoudigere visualisatie van intracellulaire calciumtransiënten mogelijk is, zowel in vitro als in vivo instellingen. Een familie van deze genetisch gecodeerde verslaggevers, bekend als GCaMP, wordt nu op grote schaal gebruikt. Deze indicatoren bevatten een C-terminaal calmodulin-domein, gevolgd door groen fluorescerend eiwit (GFP), en worden afgetopt door een N-terminaal calmodulin-bindend ^gebied35,36. Calciumbinding aan het calmodulinedomein veroorzaakt een interactie met het calmoduline-bindende gebied, wat resulteert in een conformationele verandering in de algehele eiwitstructuur en een aanzienlijke toename van de fluorescentie van het GFP-deel35,36. In de loop der jaren heeft deze familie van verslaggevers verschillende evoluties ondergaan om verschillende uitlezingen mogelijk te maken voor bepaalde calciumtransiënten met specifieke kinetiek (langzaam, gemiddeld en snel), elk met enigszins verschillende ^{eigenschappen37,38}. Hier is het gebruik van de reporter GcaMP6 benadrukt, waarvan eerder is aangetoond dat het enkelvoudige actiepotentialen en dendritische calciumtransiënten detecteert in neuronen, zowel in vivo als in ^vitro37.

Calciumtransiënten in het presynaptische gebied veroorzaken synaptische blaasjesfusiegebeurtenissen, waardoor neurotransmitterafgifte in de synaps en initiatie van signaleringsgebeurtenissen in de postsynaptische cel ^{worden veroorzaakt28,39}. Synaptische blaasjes worden zowel snel vrijgegeven als gerecycled, omdat de cel homeostatisch een stabiel celmembraanoppervlak en gemakkelijk vrij te geven pool van fusie-capabele membraangebonden blaasjes ^onderhoudt40. De hier gebruikte styrylkleurstof heeft een affiniteit met lipidemembranen en verandert specifiek de emissie-eigenschappen op basis van de ordening van de omringende ^{lipideomgeving41,42}. Het is dus een ideaal hulpmiddel voor het labelen van het recyclen van synaptische blaasjes en het volgen van deze blaasjes als ze later worden vrijgegeven na neuronale ^{stimulatie41,42}. Het protocol dat is gegenereerd en geoptimaliseerd is een aanpassing van de concepten die aanvankelijk door Gaffield en collega’s zijn beschreven, waardoor we in de loop van de tijd continu styryl dye-gelabelde synaptische vesicle puncta kunnen ^{visualiseren41}.

Hier worden twee gerelateerde op fluorescentie gebaseerde methodologieën beschreven, die op betrouwbare wijze specifieke cellulaire gebeurtenissen rapporteren die betrokken zijn bij synaptische transmissie. Protocollen zijn gedefinieerd om de dynamiek van depolarisatie-gemedieerde presynaptische terminale calciuminstroom en synaptische blaasjesexocytose in gekweekte neuronen te onderzoeken. Hier zijn methoden en representatieve resultaten gericht op het gebruik van primaire knaagdiercorticale of motorneuronen als het in vitro modelsysteem, zoals er gepubliceerde studies zijn met behulp van deze ^{celtypen43,44}. Deze methoden zijn echter ook van toepassing op gedifferentieerde menselijke ⁱ³ corticale ^neuronen45, omdat we ook succes hebben gehad met beide protocollen in de momenteel lopende experimenten in ons laboratorium. Het algemene protocol wordt geschetst in een stapsgewijs lineair formaat, weergegeven in figuur 1. Kortom, om de calciumdynamiek in neurieten te bestuderen, worden volwassen neuronen getransfecteerd met plasmide-DNA om de fluorescerende reporter GCaMP6m tot expressie te brengen onder een Cytomegalovirus (CMV) ^{promotor37,46}. Getransfecteerde cellen hebben een laag niveau van basale groene fluorescentie, die toeneemt in de aanwezigheid van calcium. Regio’s van belang worden gespecificeerd om fluorescentieveranderingen tijdens onze manipulatie te volgen. Hierdoor kunnen sterk ruimtelijk en temporeel gelokaliseerde fluctuaties in calcium worden ^gemeten37,46. Voor het evalueren van synaptische vesikelfusie en -afgifte worden volwassen neuronen geladen met styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaaskelmembranen terwijl ze worden gerecycled, hervormd en opnieuw geladen met neurotransmitters in presynaptische cellen41,42,43,47,48. De huidige kleurstoffen die voor dit doel worden gebruikt, labelen synaptische blaasjes langs neurieten en worden gebruikt als een proxy voor deze regio’s in live-imaging-experimenten, zoals werd aangetoond door co-kleuring van styrylkleurstof en synaptotagmin door Kraszewski en ^{collega’s49}. Hier zijn representatieve afbeeldingen van vergelijkbare kleuringen opgenomen die ook zijn uitgevoerd (figuur 2A). Eerdere onderzoekers hebben dergelijke kleurstoffen uitgebreid gebruikt om synaptische blaasjesdynamica op de neuromusculaire kruising en hippocampale neuronen te rapporteren48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Door punctategebieden van met kleurstof beladen blaasjes te selecteren en door de afname van de fluorescentie-intensiteit na afgifte van het blaasje te monitoren, kunnen de functionele synaptische transmissiecapaciteit en de temporele dynamiek van afgifte na stimulatie worden ^bestudeerd43. Voor beide methoden wordt een medium met een hoge concentratie kaliumchloride gebruikt om cellen te depolariseren om neuronale activiteit na te bootsen. Beeldparameters worden gespecificeerd om intervallen van minder dan een seconde vast te leggen die een basislijnnormalisatie omvatten, gevolgd door onze stimulatie-opnameperiode. Fluorescentiemetingen op elk tijdstip worden bepaald, genormaliseerd naar de achtergrond en gekwantificeerd over de experimentele periode. Calciuminstroom gemedieerde GCaMP6m fluorescentie toename of effectieve synaptische vesikel exocytose styryl kleurstof afgifte fluorescentie afname kan worden gedetecteerd door middel van deze strategie. Gedetailleerde methodologische instellingen en parameters voor deze twee protocollen en een discussie over hun voordelen en beperkingen worden hieronder beschreven.

Figuur 1: Visuele weergave van het algemene protocolproces. (1) Isoleer en kweek primaire knaagdierneuronen in vitro tot het gekozen rijpingstijdpunt. (2) Introduceer GCaMP DNA of styrylkleurstof als verslaggevers van synaptische activiteit. (3) Stel het beeldvormingsparadigma in met behulp van live-imaging uitgeruste confocale microscoop en bijbehorende software. Begin de registratieperiode van de basislijn. (4) Terwijl cellen nog steeds live-image capture ondergaan, stimuleren neuronen via hoge KCl-badperfusie. (5) Beoordeel fluorescentie-intensiteitsmetingen in de loop van de tijd om calciumtransiënten of synaptische blaasjesfusie te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.