Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

A modelagem da esclerose lateral amiotrófica (ELA) em laboratório é feita de forma singularmente desafiadora devido à natureza esmagadoramente esporádica de mais de 80% dos ^casos1, juntamente com o grande número de mutações genéticas conhecidas como causagens da ^doença2. Apesar disso, todos os casos de ELA compartilham a característica unificadora de que antes da degeneração neuronal total, há comunicação disfuncional entre neurônios motores pré-sinápticos e células musculares postsináspticas3,4. Clinicamente, à medida que os pacientes perdem a conectividade dos neurônios motores superiores e inferiores restantes, eles apresentam características de hiperexcitabilidade neuronal ao longo da doença5,6,7,8,9, refletindo complexas mudanças moleculares subjacentes a essas sinapses, que nós, como pesquisadores da ALS, buscamos entender.

Múltiplos modelos transgênicos ilustraram que a deterioração e a desorganização da junção neuromuscular ocorrem com a expressão de mutações genéticas causagens causal da ELA, incluindo ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 através de avaliações morfológicas, incluindo avaliação de boutons sinápticos, densidades da coluna vertebral e organização pré/postiática. Mecanicamente, desde os trabalhos marcantes de Cole, Hodgkin e Huxley na década de 1930, também foi possível avaliar respostas sinápticas através de técnicas eletrofisiológicas na cultura celular in vitro ou preparações de fatias de ^tecido20. Por meio dessas estratégias, muitos modelos de ELA têm demonstrado déficits de transmissão sináptica. Por exemplo, uma variante mutante do TDP43 causa maior frequência de disparo e diminui o limiar potencial de ação em NSC-34 (medula espinhal x neuroblastoma célula híbrida linha 34) células semelhantes a neurônios ^motores21. Esta mesma variante também causa transmissão sináptica disfuncional na junção neuromuscular (NMJ) antes do início de déficits motores comportamentais em um modelo de ^mouse22. Foi mostrado anteriormente que a expressão de FUS mutante resulta em transmissão sináptica reduzida no NMJ em um modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defeitos locomotor11. Um relatório recente usando células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de portadores de expansão C9orf72 revelou uma redução no pool facilmente liberado de vesículas ^sináptica23. Ao todo, esses estudos e outros destacam a importância de construir uma compreensão mais abrangente dos mecanismos subjacentes à sinalização sináptica em modelos relevantes para doenças da ELA. Isso será fundamental na compreensão da trajetória da ELA e no desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos para os pacientes.

Métodos de células de fixação de corrente e tensão têm sido inestimáveis na determinação de propriedades de membrana, como conduance, potencial de membrana de repouso e teor de sinapses ^{individuais20,24}. No entanto, uma das limitações significativas da eletrofisiologia é que ela é tecnicamente desafiadora e só fornece insights de um único neurônio de cada vez. A microscopia confocal de células vivas, juntamente com sondas fluorescentes específicas, oferece a oportunidade de investigar a transmissão sináptica de neurônios de forma espesso25,26,27. Embora não seja uma medida direta de excitabilidade neuronal, essa abordagem de fluorescência pode fornecer uma medição relativa de duas correlações moleculares da função sináptica: liberação de vesícula sináptica e transitórios de cálcio em terminais sinápticos.

Quando um potencial de ação atinge a região terminal pré-sináptica dos neurônios, os transitórios de cálcio são acionados, facilitando a transição de um sinal elétrico para o processo de liberação de neurotransmissores28. Canais de cálcio fechados de tensão localizados nessas áreas regulam fortemente a sinalização de cálcio para modular a cinética da liberação de neurotransmissores29. As primeiras gravações relatadas baseadas em fluorescência de transitórios de cálcio foram realizadas utilizando-se o indicador de comprimento de onda dupla Fura-2 AM ou o único corante de comprimento de onda Fluo-3 AM30,31,32. Embora esses corantes tenham oferecido uma nova visão na época, eles sofrem de várias limitações, como compartimentação não específica dentro das células, perda de corante ativo ou passivo de células rotuladas, fotobleaching e toxicidade se imagens por longos períodos de ^tempo33. Na última década, indicadores de cálcio geneticamente codificados tornaram-se os cavalos de trabalho para a imagem de várias formas de atividade neuronal. Esses indicadores combinam uma proteína fluorescente modificada com uma proteína querador de cálcio que muda rapidamente a intensidade da fluorescência após a ligação de íons ^ca2+34. A aplicação desses novos indicadores é vasta, permitindo uma visualização muito mais fácil de transintes intracelulares de cálcio tanto em configurações in vitro quanto in vivo. Uma família desses repórteres geneticamente codificados, conhecido como GCaMP, agora são amplamente utilizados. Esses indicadores contêm domínio de calmodulina terminal C, seguidos de proteína fluorescente verde (GFP), e são limitados por uma região de ligação de autodulina terminal ^N35,36. A ligação de cálcio ao domínio calmodulin desencadeia uma interação com a região de ligação de calmodulin, resultando em uma mudança conformacional na estrutura geral da proteína e um aumento substancial na fluorescência da ^{moiety35,36 gfp}. Ao longo dos anos, essa família de repórteres passou por várias evoluções para permitir leituras distintas para transitórios de cálcio específicos com cinética específica (lenta, média e rápida), cada uma com propriedades ligeiramente ^{diferentes37,38}. Aqui, foi destacado o uso do repórter GcaMP6, que já foi demonstrado anteriormente para detectar potenciais de ação única e transitórios de cálcio dendráticos em neurônios tanto in vivo quanto in ^vitro37.

Transitórios de cálcio na região pré-sináptica desencadeiam eventos de fusão de vesícula sináptica, causando liberação de neurotransmissores na sinapse e início de eventos de sinalização na célula postsinásptica28,39. As vesículas sinápticas são rapidamente liberadas e recicladas, já que a célula homeostaticamente mantém uma área de superfície de membrana celular estável e uma piscina prontamente liberada de vesículas ligadas à membrana ⁴⁰. O corante de estirida usado aqui tem afinidade com membranas lipídicas e altera especificamente suas propriedades de emissão com base no ordenamento do ambiente lipídemo ^{circundante41,42}. Assim, é uma ferramenta ideal para rotular vesículas sinápticas de reciclagem e posterior rastreamento dessas vesículas, pois elas são posteriormente liberadas após estimulação ^{neuronal41,42}. O protocolo que foi gerado e otimizado é uma adaptação dos conceitos descritos inicialmente por Gaffield e colegas, o que nos permite visualizar puncta styryl com tinta styryl ao longo do tempo ^{continuamente41}.

Aqui, são descritas duas metodologias relacionadas baseadas em fluorescência, relatando de forma confiável eventos celulares específicos envolvidos na transmissão sináptica. Protocolos foram definidos para sondar a dinâmica do influxo de cálcio terminal pré-sináptico mediado pela despolarização e excitose de vesícula sináptica em neurônios cultivados. Aqui, métodos e resultados representativos estão focados no uso de neurônios cortical ou motor primários como o sistema de modelo in vitro, pois há estudos publicados utilizando esses tipos de células43,44. No entanto, esses métodos também são aplicáveis a neurônios humanos diferenciados como ^{i3 cortical45}, pois também tivemos sucesso com ambos os protocolos em experimentação atualmente em curso em nosso laboratório. O protocolo geral é delineado em um formato linear stepwise, mostrado na Figura 1. Resumindo, para estudar a dinâmica do cálcio em neurites, os neurônios maduros são transfectados com DNA plasmídeo para expressar o repórter fluorescente GCaMP6m sob um promotor de Cytomegalovirus (CMV)^37,46. As células transfeinadas têm um baixo nível de fluorescência verde basal, o que aumenta na presença de cálcio. Regiões de interesse são especificadas para monitorar as mudanças de fluorescência ao longo de nossa manipulação. Isso permite que flutuações altamente espacial e temporalmente localizadas no cálcio sejam ^medidas37,46. Para avaliar a fusão e liberação de vesículas sinápticas, os neurônios maduros são carregados com corante estilístico incorporado em membranas vesículas sinápticas à medida que são reciclados, reformados e recarregados com neurotransmissores em células pré-sinápticas41,42,43,47,48. Os corantes atuais utilizados para este fim rotulam vesículas sinápticas ao longo de neurites e são usados como proxy para essas regiões em experimentos de imagem ao vivo, como foi mostrado pela co-coloração de corante e sinaptomin por Kraszewski e ^colegas49. Aqui estão incluídas imagens representativas de manchas semelhantes que também foram realizadas (Figura 2A). Pesquisadores anteriores usaram extensivamente tais corantes para relatar a dinâmica da vesícula sináptica na junção neuromuscular e neurônios hipocampais48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selecionando regiões pontuadas de vesículas carregadas de corante e monitorando a diminuição da intensidade da fluorescência após a liberação da vesícula, a capacidade de transmissão sináptica funcional e a dinâmica temporal de liberação podem ser estudadas após a ^{estimulação43}. Para ambos os métodos, um meio contendo uma alta concentração de cloreto de potássio é empregado para despolarizar células para imitar a atividade neuronal. Os parâmetros de imagem são especificados para capturar intervalos sub-segundos que abrangem uma normalização da linha de base seguida pelo nosso período de captura de estimulação. As medidas de fluorescência em cada ponto de tempo são determinadas, normalizadas ao fundo e quantificadas ao longo do período experimental. O aumento da fluorescência GCaMP6m mediada por influxo de cálcio ou o aumento efetivo da excitose styísica styryl de isca de isca podem ser detectados através desta estratégia. Configuração metodológica detalhada e parâmetros para esses dois protocolos e uma discussão sobre suas vantagens e limitações são descritos abaixo.

Figura 1: Renderização visual do processo geral de protocolo geral. (1) Isolados e cultura neurônios roedores primários in vitro ao ponto de tempo de maturação escolhido. (2) Introduzir o DNA GCaMP ou o corante de estilílico como repórteres de atividade sináptica. (3) Configuração de paradigma de imagem usando microscópio confocal equipado de imagem ao vivo e software associado. Inicie o período de gravação da linha de base. (4) Enquanto as células ainda estão em captura de imagem ao vivo, estimule os neurônios através da perfusão de banho KCl alto. (5) Avalie as medidas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para medir transitórios de cálcio ou fusão de vesícula sináptica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.