Summary

Transuterine foetale tracheale occlusie model in muizen

Published: February 05, 2021
doi:

Summary

Verschillende diermodellen van congenitale diafragmatische hernia en foetale tracheale occlusie bieden voor- en nadelen met betrekking tot ethische kwesties, kosten, chirurgische moeilijkheidsgraad, grootte, overlevingspercentages en beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Dit model biedt een nieuw hulpmiddel om de impact van zowel tracheale occlusie als verhoogde luminale druk op de longontwikkeling te bestuderen.

Abstract

Foetale tracheale occlusie (TO), een gevestigde behandelingsmodaliteit, bevordert foetale longgroei en overleving bij ernstige aangeboren diafragmatische hernia (CDH). Na TO verhoogt het vasthouden van de afgescheiden epitheelvloeistof de lichtdruk en induceert het longgroei. Verschillende diermodellen zijn gedefinieerd om de pathofysiologie van CDH en TO te begrijpen. Ze hebben allemaal hun eigen voor- en nadelen, zoals de moeilijkheidsgraad van de techniek, de grootte van het dier, de kosten, hoge sterftecijfers en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Hierin wordt een nieuw trans-uterien model van muriene foetale TO beschreven. Zwangere muizen werden verdoofd en de baarmoeder werd blootgesteld via een laparotomie in de middellijn. De luchtpijp van geselecteerde foetussen werd geligeerd met een enkele trans-uteriene hechting achter de luchtpijp, een halsslagader en een halsslagader. De dam werd gesloten en mocht herstellen. Foetussen werden vlak voor de bevalling verzameld. Long-lichaamsgewichtverhouding bij TO-foetussen was hoger dan die bij controlefoees. Dit model biedt onderzoekers een nieuw hulpmiddel om de impact van zowel TO als verhoogde luminale druk op de longontwikkeling te bestuderen.

Introduction

Congenitale diafragmatische hernia (CDH) komt voor bij 1:2500 zwangerschappen en resulteert in pulmonale hypoplasie en neonatale pulmonale hypertensie1,2,3,4,5,6. Foetale tracheale occlusie (TO) is een gevestigde prenatale therapie bij ernstige CDH-patiënten waarbij fetoscopie nodig is in de 26-30e zwangerschapsweek waarin een ballon net boven de carina wordt geplaatst en vervolgens in de 32e zwangerschapsweek wordt verwijderd. Deze tijdelijke TO induceert foetale longgroei en verbetert de overleving. Congenitaal High Airway Obstruction Syndrome is een dodelijke aandoening geassocieerd met longhyperplasie, die chirurgen inspireerde om kunstmatige occlusie van de luchtpijp uit te voeren om het vasthouden van het uitgescheiden epitheelvocht te bevorderen. Deze occlusie verhoogde de lichtgevende druk en veroorzaakte longgroei7. De occlusie moet echter worden omgekeerd om epitheliale celrijping mogelijk te maken.

Verschillende diermodellen van CDH en TO – schapen, konijnen, ratten en muizen – zijn ontwikkeld om de pathofysiologie van CDH en TO te begrijpen. Ze hebben allemaal hun eigen voor- en nadelen, zoals de moeilijkheidsgraad van de techniek, de grootte van het dier, de kosten, hoge sterftecijfers en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Hoewel de chirurgische techniek die wordt gebruikt voor het schapenmodel erg lijkt op die bij mensen en kan worden omgekeerd, zijn de belangrijkste nadelen van dit model de kosten van het dier, de lange zwangerschapsperiode en het beperkte aantal operaties mogelijk. Het konijnenmodel heeft een kortere draagtijd en is goedkoper dan het schapenmodel. Het konijnenmodel is echter onomkeerbaar8,9. Het muriene model heeft de laagste kosten, het hoogste aantal foetussen per zwangerschap, het best gekarakteriseerde genoom en algemeen beschikbare hulpmiddelen voor cellulaire en moleculaire analyses. Een belangrijk nadeel is echter het gebrek aan reversibiliteit van de TO, waardoor volledig begrip van de impact van TO wordt voorkomen. Hierin wordt een methode gepresenteerd die alle voordelen van de eerder genoemde modellen combineert en een eenvoudig, potentieel omkeerbaar en minimaal invasief knaagdier TO-model creëert.

Protocol

Alle experimenten zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, herzien 1978). De procedure werd goedgekeurd met IACUC protocol #2016-0068 door de Cincinnati Children’s Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Voorbereiding Om leeftijdsgematchte wild-type (WT) C57BL/6 muizen te paren, plaatst u ze om 18:00 uur in dezelfde kooi.m. en scheidt u ze de volgende dag om 9…

Representative Results

Deze studie onderzocht 37 foetussen: 20 (54,1%) vs. 17 (45,9%) als controle. Omdat de luchtpijp niet kon worden afgesloten bij 4 foetussen in de TO-groep, werden ze uitgesloten van het onderzoek. Er was geen significant verschil in mortaliteit in beide groepen: 4 foetussen (25%) in de TO-groep en 2 foetussen (12%) in de controlegroep (p=0,334, odds ratio (OR) 2,5, 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 0,39-16,05). Het gemiddelde lichaamsgewicht, het longgewicht en de verhouding tussen longen …

Discussion

Deze methode beschrijft een chirurgische procedure van foetale tracheale occlusie bij muizen en de impact ervan op de longontwikkeling. Er zijn enkele kritieke stappen in het protocol die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd voor een succesvolle TO. De warmte van het platform waarop de operatie plaatsvindt en de zoutoplossing die in de buikholte wordt geïntroduceerd, is cruciaal voor de progressie van de zwangerschap. Bovendien moet een lichte druk worden uitgeoefend op het hoofd van de pups om blootstelling van de nek t…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek heeft geen specifieke subsidie ontvangen van financieringsinstellingen in de publieke, commerciële of non-profitsector. Alle auteurs hebben een substantiële bijdrage geleverd aan de conceptie en het ontwerp van de studie, verwerving, analyse en interpretatie van gegevens, het opstellen van het artikel en het herzien ervan voor belangrijke intellectuele inhoud en definitieve goedkeuring van de in te dienen versie. De auteurs danken Can Sabuncuoğlu voor zijn vriendelijke inspanningen voor de productie van het kunstwerk van de chirurgische techniek.

Materials

Buprenorphine  Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 For regional anesthesia
Isoflurane   Halocarbon Life Sciences NDC 66794-017-25 For general anesthesia
Magnification glasses USA Medical-Surgical SLR-250LBLK At least 2.5x
Nikon 90i microscope Nikon 3417 Motorized Fluorescence
Nucleospin Tissue Kit  Macherey-Nagel, Düren, Germany 740952.5 DNA isolation
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher, IL, USA 23225 Protein quantification
Polyglactin suture Ethicon VCP451H 4-0, 24 mm, cutting
Polylysine slides  VWR  48382-117 Microscope adhesion slides
Polypropylene suture Ethicon Y432H 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint
RIPA buffer  Sigma-Aldrich, Missouri, USA R0278-50ml Protein isolation
Silk suture Ethicon VCP682G 4-0, 24 mm, cutting
Trizol  Invitrogen  15596026 RNA isolation

Referenzen

  1. Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
  2. Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
  3. Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
  4. Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
  5. Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
  6. Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
  7. Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
  8. Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
  9. Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
  10. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  11. Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
  12. Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Aydın, E., Joshi, R., Oria, M., Lim, F., Varisco, B. M., Peiro, J. L. Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice. J. Vis. Exp. (168), e61772, doi:10.3791/61772 (2021).

View Video