Modelo de oclusión traqueal fetal transuterina en ratones
Summary
Varios modelos animales de hernia diafragmática congénita y oclusión traqueal fetal presentan ventajas y desventajas con respecto a cuestiones éticas, costo, dificultad quirúrgica, tamaño, tasas de supervivencia y disponibilidad de herramientas genéticas. Este modelo proporciona una nueva herramienta para estudiar el impacto de la oclusión traqueal y el aumento de la presión luminal en el desarrollo pulmonar.
Abstract
La oclusión traqueal fetal (TO), una modalidad de tratamiento establecida, promueve el crecimiento pulmonar fetal y la supervivencia en hernia diafragmática congénita grave (CDH). Después de TO, la retención del líquido epitelial secreto aumenta la presión luminal e induce el crecimiento pulmonar. Se han definido varios modelos animales para entender la fisiopatología de CDH y TO. Todos tienen sus propias ventajas y desventajas como la dificultad de la técnica, el tamaño del animal, el costo, las altas tasas de mortalidad y la disponibilidad de herramientas genéticas. En este documento, se describe un nuevo modelo transuterino de TO fetal murino. Los ratones embarazadas fueron anestesiados y el útero expuesto a través de una laparotomía de línea media. La tráquea de fetos seleccionados se ligaron con una sola sutura transuterina colocada detrás de la tráquea, una arteria carótida y una vena yugular. La presa fue cerrada y se le permitió recuperarse. Los fetos fueron recogidos justo antes de la parto. La relación entre pulmón y peso corporal en los fetos TO fue mayor que la de los fetos de control. Este modelo proporciona a los investigadores una nueva herramienta para estudiar el impacto de to y aumento de la presión luminal en el desarrollo pulmonar.
Introduction
La hernia diafragmática congénita (CDH) ocurre en 1:2500 embarazos y da como resultado hipoplasia pulmonar e hipertensión pulmonar neonatal1,2,3,4,5,6. La oclusión traqueal fetal (TO) es una terapia prenatal establecida en pacientes graves con CDH que involucran fetoscopia en la semanagestacional 26-30 en la que se coloca un globo justo por encima de la carina y luego se retira en la semanagestacional 32. Este TEMPORAL PARA INducir el crecimiento pulmonar fetal y mejora la supervivencia. El síndrome congénito de obstrucción de las vías respiratorias altas es una condición letal asociada con la hiperplasia pulmonar, que inspiró a los cirujanos a realizar la oclusión artificial de la tráquea para promover la retención del líquido epitelial secreto. Esta oclusión aumentó la presión luminal y indujo el crecimiento pulmonar7. Sin embargo, la oclusión debe revertirse para permitir la maduración de células epiteliales.
Varios modelos animales de CDH y TO – ovino, conejo, rata y ratón – han sido desarrollados para entender la fisiopatología de CDH y TO. Todos tienen sus propias ventajas y desventajas como la dificultad de la técnica, el tamaño del animal, el costo, las altas tasas de mortalidad y la disponibilidad de herramientas genéticas. Aunque la técnica quirúrgica utilizada para el modelo ovino es muy similar a la utilizada en los seres humanos y podría revertirse, los principales inconvenientes de este modelo son el gasto del animal, el largo período gestacional y el número limitado de cirugías posibles. El modelo de conejo tiene un período gestacional más corto y es menos costoso que el modelo de oveja. Sin embargo, el modelo de conejo es irreversible8,9. El modelo murino tiene el costo más bajo, el mayor número de fetos por embarazo, el genoma mejor caracterizado y herramientas ampliamente disponibles para análisis celulares y moleculares. Sin embargo, un inconveniente clave es la falta de reversibilidad de la TO, evitando la comprensión completa del impacto de TO. En este documento, se presenta un método que combina todas las ventajas de los modelos anteriormente mencionados y crea un modelo TO de roedor fácil, potencialmente reversible y mínimamente invasivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método describe un procedimiento quirúrgico de oclusión traqueal fetal en ratones y su impacto en el desarrollo pulmonar. Hay algunos pasos críticos en el protocolo que deben realizarse cuidadosamente para lograr un to correctamente. El calor de la plataforma en la que se lleva a cabo la cirugía y la solución salina introducida en la cavidad peritoneal es crucial para la progresión del embarazo. Además, se debe aplicar una ligera presión en la cabeza de los cachorros para garantizar la exposición del cuell…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de las agencias de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro. Todos los autores han hecho contribuciones sustanciales a la concepción y el diseño del estudio, adquisición, análisis e interpretación de datos, redactando el artículo y revisándolo para obtener contenido intelectual importante y la aprobación final de la versión que se presentará. Los autores agradecen a Can Sabuncuoğlu por sus amables esfuerzos en la producción de la obra de arte de la técnica quirúrgica.
Materials
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
Referenzen
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
