Här ger vi ett protokoll för att generera in vitro-NMJs från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Denna metod kan inducera NMJs med mogen morfologi och funktion i 1 månad i en enda brunn. De resulterande NMJs skulle kunna användas för att modellera relaterade sjukdomar, att studera patologiska mekanismer eller att skärmen läkemedelsföreningar för terapi.
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en specialiserad synaps som överför aktionspotentialer från motor neuron till skelettmuskulatur för mekanisk rörelse. Arkitekturen av NMJEN strukturerar påverkan fungerar av neuronen, muskeln och den ömsesidiga växelverkan. Tidigare studier har rapporterat många strategier genom co-culturing motor nervceller och myotubes att generera NMJ in vitro med komplexa induktionsprocessen och lång kultur period men har kämpat för att rekapitulera mogna NMJ morfologi och funktion. Vårt in vitro NMJ induktionssystem är konstruerat genom att differentiera mänsklig iPSC i en enda kulturskål. Genom att byta myogenic och neurogenic induktionsmedium för induktion, den resulterande NMJ innehöll pre- och post- synaptiska komponenter, inklusive motor nervceller, skelettmuskulatur och Schwann celler i en månad kultur. Den funktionella analysen av NMJ visade också att myotubes kontraktion kan utlösas av Ca++ sedan hämmas av curare, en acetylkolin receptor (AChR) hämmare, där den stimulerande signalen överförs genom NMJ. Denna enkla och robusta metod framgångsrikt härlett den komplexa strukturen av NMJ med funktionell anslutning. Denna in vitro mänskliga NMJ, med dess integrerade strukturer och funktion, har lovande potential för att studera patologiska mekanismer och sammansatta screening.
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en specialiserad synaps som överför signaler från motoriska nervceller till skelettmuskulaturen för att kontrollera frivilliga muskelrörelser1,2. Denna synaps består av pre- och postsynaptiska delar. I den presynaptiska delen frigör den motoriska neuronen acetylkolin (ACh) från synaptiska vesiklar genom exocytos. ACh frigörs från synaptiska vesiklar att korsa synaptiska spalten och att binda till AChR på den post-synaptiska delen att utlösa en åtgärd potential för muskelkontraktion3,4. Varje fel i denna känsliga struktur kan orsaka NMJ sjukdomar, inklusive spinal muskelatrofi (SMA), medfödda myasthenic syndrom (CMS), myasthenia gravis (MG)5,6,7, etc. Dessa sjukdomar skadar kraftigt kvaliteten på patienternas liv och har tyvärr inga effektiva behandlingsmetoder på grund av bristen på förståelse för den patologiska mekanismen. I denna studie, Vi syftade till att generera in vitro mänskliga NMJ från mänskliga iPSCs för korrekt sjukdom modellering och för terapeutiska föreningar screening.
Tidigare studier har visat möjligheten att generera in vitro NMJ genom samkultur strategier. De motoriska nervceller och skelett myotubes genereras respektive. De två celltyperna kan genereras från human- eller mus primärvävnadskulturer eller induceras från stamceller8,9,10,11 och sedan samkulturerade för NMJ-bildning. De ytterligare tillämpningarna omfattar att sammanfoga det samkulturerade NMJ till mikrofluidiska 3D-enheter och att använda optogenetiska enheter för kvantifierbara funktionsanalyser12,13. Emellertid, dessa strategier tar en lång kultur period och kräver kamp för att få de primära komponenterna i NMJ, antingen motor neuron eller skelettet myotube samtidigt. Ännu en viktig komponent i NMJ, Schwann-cellen, kan inte genereras i dessa kultursystem. Det avancerade odlingssystemet som innehåller myotube, motor neuron och Schwann cell är önskvärt eftersom det kan erbjuda en tillförlitlig och robust modell för NMJ studier.
Myogenic Differentiering 1 (MYOD1) är en välkänd myogenic regulator för myogenesis14. Den effektiva myogenic differentiering metod som tillämpas MYOD1 att driva iPSC i myotubes byggdes i en tidigare studie15. Därför, Vi inducerade myotubes genom överuttrycker MYOD1 i iPSCs15, och hög effektivitet av myogenic differentiering visades. Intressant, neuron celler dök upp tillsammans med myotubes spontant efter dag 10. Utseendet på neuronceller i myogen kultur har lett oss att utveckla strategin för att generera in vitro NMJ i en enda maträtt. Här ger vi en strategi för att generera NMJs genom att överuttrycka MYOD1 i mänskliga iPSCs för myogenic och motor neuron induktion i samma kultur skålen. Motorneverna induceras spontant med flera neurotrofa faktorer (GDNF, BDNF, NT3 etc.) 8, och under tiden kan Schwann cellerna också induceras16,17. Genom interaktionerna mellan myotubes, motor nervceller och Schwann cellerna, den mogna NMJ bildas18. Denna metod kan generera funktionella NMJ effektivt, möjliggör den potentiella studie av patologiska mekanismer och terapeutiska sammansatta screening.
Tidigare studier har rapporterat metoder för NMJ-bildning in vitro med sofistikerade metoder som kräver långvarigkultur 8,10,12,13,20. Dessa prestationer leder utvecklingen av in vitro NMJ. Men hindrade de komplicerade metodikerna åtkomsten av NMJ-studier. Vårt protokoll undviker samkultur för att generera NMJs effektivt och robust i en enda brunn. Tre celltyper i NMJ observerades i vårt induktionssystem, inklusive myotubes, motor nervceller och Schwann cellerna18. Dessutom var mogna morfologi och funktion verifieras.
Baserat på vår tidigare studie är den initiala celltätheten en kritisk faktor för NMJ-bildning, och olika celltätheter framkallar olika antal NMJs i kulturen18. En låg celltäthet (< 1 x 104/cm2) inducerade ett lågt antal nervceller, vilket är ogynnsamt för NMJ-bildning. Även om det skulle ta mycket mer tid och resurser för att förbereda en högre densitet av celler (> 1 x 105/cm2), rekommenderar vi att celltätheten vara mellan 1,5 x 104/cm2 och 5 x 104/cm2 med hjälp av vårt protokoll. DEN NMJ som genereras av detta protokoll är en heterogen vävnad med flera celltyper som är närmare att efterlikna fysiologiska tillstånd. Myotubesna finnas för att jämnt fördela på en kulturskål men de motoriska neuronerna visas slumpmässigt, av som fenomen resulterar i ojämnt fördelning av NMJs i en kultur. Detta NMJ är passande för kvalitativa studier i stället för analysen som kräver homogena kultursystem. Vi använde också andra cellinjer, eq., H9 (ES-cellinje)18 och A11 (iPS-cellinje, data som inte visas) för att generera NMJ av detta protokoll. Den NMJ kan genereras framgångsrikt i morfologi och funktion. Odlingsvillkoret behöver ändå optimeras för olika cellinjer.
Den kemiskt utlöste myotubes kontraktion och curare-beroende hämning bekräftade att vår in vitro NMJ var funktionell och skulle kunna tillämpas för praktiska analyser. Spontana muskelsammandragningar observerades slumpmässigt vid 3\u20124 veckor av kultur, men det kunde undvikas genom att förlänga kulturtiden till så länge som två månader18.
Olika strategier har publicerats för att generera in vitro NMJ av olika mognadsstadium, men in vitro NMJ genereras i vårt system visade den betydande mognad, som vi kan observera övergången av gamma till epsilon underenheter av AChR under kulturen18. Mognad är ett viktigt övervägande för sjukdomsmodellering med in vitro NMJ21. Sammanfattningsvis är en in vitro NMJ med integrerade strukturella komponenter, mognad och funktion av potentiell användning för terapeutisk utveckling.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Sakurai för vänligt tillhandahålla 201B7MYOD. Elektronmikroskopistudien stöddes av Keiko Okamoto-Furuta och Haruyasu Kohda (Avdelningen för elektronmikroskopisk studie, Centrum för anatomiska studier, Forskarskolan i medicin, Kyoto University). Den monoklonala antikroppen har utvecklats av HHMI / Columbia University, som erhållits från Developmental Studies Hybridoma Bank, skapad av National Institute Child Health och mänsklig utveckling av NIH, och underhålls vid institutionen för biologi, University of Iowa. Vi tackar också Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa och Eriko Matsui för rörelse vektor analys. Detta arbete stöddes av finansiering från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, bidragsnummer 16H05352 och 20H03642 (till MKS); iPS Cell Research Fund (till CYL och MKS); Mochida Memorial Foundation för medicinsk och farmaceutisk forskning (till MKS); Takeda Science Foundation (till MKS); och ett bidrag från Programmet för svårbehandlade sjukdomar Forskning utnyttja sjukdomsspecifika iPS-celler, som fick hjälp av Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 till CYL och MKS, och 17935423 till MKS).
Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
Doxycycline | Takara | 631311 | |
ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
SEM | Hitachi | S-4700 | |
TEM | Hitachi | H7650 | |
Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |